IFN-τ通过影响bta-miR-152等miRNA调控BoLA-I重链表达的分子预测

发布时间：2018-07-15 15:04

【摘要】：胚胎着床期妊娠障碍是导致奶牛繁殖失败的最主要原因之一。胚胎植入和胚胎的早期发育是妊娠过程中最为关键的因素,胎盘作为联系母体与胎儿的母胎界面,可通过在滋养层细胞和相关组织表达某些免疫因子来保护胎儿免受母体免疫系统的排斥,即免疫耐受,这种免疫耐受即妊娠的建立与维持依赖于MHC-I的正确表达。牛MHC-I称为Bo LA-I,具有高度多态性,其经典(Bo LA-Ia)和非经典的I类(Bo LA-Ib)分子均于特定时期在牛胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中表达且与妊娠免疫密切相关。IFN-τ于胚胎植入期由胚胎滋养层细胞分泌,为反刍动物妊娠识别因子,可上调表达Bo LA-I重链,对胚胎植入有一定的调节作用。mi RNA是一类短的内源性非编码单链RNA,长度约为22 nt,能与靶m RNA结合位点互补配对来调节基因的表达。mi RNA在许多细胞活动的调节过程中具有关键作用,也有研究发现mi RNA参与MHC-I的蛋白表达,但目前关于其在IFN-τ调节子宫内膜上皮细胞中Bo LA-I表达的过程中发挥的作用还不了解。本试验以分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞为基础,采用200ng/m L IFN-τ作用于细胞;通过高通量测序技术获得IFN-τ处理不同时间的细胞中mi RNA的表达情况,筛选出差异表达的mi RNA,同时预测差异表达mi RNA的靶基因;对其靶基因进行基因功能注释(GO)和信号通路注释(Pathway)分析,以期预测与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达Bo LA-I相关的重要mi RNA,为进一步研究奶牛妊娠免疫机制提供试验依据。本研究主要结果如下:1.奶牛子宫内膜上皮细胞总RNA的制备及质检本实验设定200ng/m L IFN-τ作用于奶牛子宫内膜上皮细胞,时间分别为0h、6h和12h,并分别设置各时间的对照组,提取各组细胞总RNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop超微量分光光度计、Qubit 2.0 Fluorometer荧光计、Agilent 2100检测各组样品总RNA的降解程度、纯度、完整性等,结果表明各组样品总RNA纯度高、完整性好、无明显蛋白污染,符合建库要求。2.奶牛子宫内膜上皮细胞mi RNA测序分析以上样品用于构建c DNA文库,文库经质检合格后即按照数据量需求进行RNA-seq测序,分析mi RNA在各组样品中的表达模式。通过对测序数据进行质量评估发现,各组样品RNA文库中碱基错误识别率均为0.01%,GC含量在47.34%~48.53%之间,位于正常范围且较为均一。对原始测序序列过滤后,获得的纯净序列占原始序列的比例位于97.38%~98.76%;对纯净序列进行长度分析发现,在0h,22 nt所占比例最大,约为37.75%,在6和12h,23 nt占有的比例最大,约为42.72%。牛基因组定位分析结果表明,各样品RNA文库中有约60%的序列能够比对到牛基因组,注释较为完整。基于序列的同源性和保守性,本研究共鉴定出574个已知mi RNA,并发现109个新mi RNA。在已知mi RNA中,有338个在各时间的实验组和对照组中都有表达,但表达量有差异;新发现的mi RNA表达量均较低,但有14个在所有样品中有表达。对以上683个mi RNA进行表达分析发现bta-mi R-21-5p在各组中的表达量都是最高的,mir-148家族成员也在各组样品中以中等丰度表达,而novel_1在109个新发现的mi RNA中表达量整体最高。另外,在以上683个mi RNA中共有464个差异表达的mi RNA,其中291个在各实验组中均有差异表达,而有173个在各对照组差异表达。在差异表达的mi RNA中,bta-mi R-181c、bta-mi R-181d和bta-mi R-152与Bo LA-I相关,其中,bta-mi R-181c和bta-mi R-181d在6h和12h时间组均下调表达;各组bta-mi R-152的表达与0小时比较均表现为上调(除12h实验组),但在6h实验组中的表达量明显低于6h对照组。结果说明IFN-τ下调了bta-mi R-152的表达。对差异表达的mi RNA进行靶基因预测和GO及KEGG通路分析发现,这些靶基因主要被富集到代谢过程和催化活性等,也被显著富集到免疫应答(immune response)和免疫过程(immune system process)。这些靶基因也有被富集到一些经典的代谢通路,以及同种移植物排斥、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等自体免疫相关通路。在富集到这些免疫相关的功能注释和信号通路的靶基因中均包含Bo LA-I重链基因。以上结果说明IFN-τ可通过影响mi RNA调控多种基因,进而调节奶牛妊娠免疫。相关基因及其作用机制尚需要进一步的研究去验证和阐明。结论:IFN-τ可通过影响bta-mi R-152等mi RNA调控Bo LA-I重链的表达。
[Abstract]:In this study , the expression of mi - RNA in bovine endometrium epithelial cells was studied by means of high - throughput sequencing . The results were as follows : 1 . The expression of the mRNA of Bo LA - I was detected by high - throughput sequencing . The results showed that the total RNA purity was high , the integrity was good , no significant protein contamination was found in each group . The results showed that there were about 60 % of the samples in each group . The expression of bta - mi R - 152 and bta - mi R - 181d were down - regulated in both 6h and 12h . The expression of bta - mi R - 152 in the experimental group was significantly lower than that in the control group . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . The results showed that IFN - 蟿 downregulated the expression of bta - mi R - 152 . These target genes were mainly enriched in metabolic process and catalytic activity , and were also significantly enriched to immune response and immune system process . Conclusion : IFN - 蟿 can regulate the expression of Bo LA - I heavy chain by affecting the mi RNA of bta - mi R - 152 . Conclusion : IFN - 蟿 can regulate the expression of Bo LA - I heavy chain by affecting the mi RNA of bta - mi R - 152 .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23

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