两种mTOR复合物在奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成中的作用及对比分析

发布时间：2018-07-15 16:00

【摘要】：乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(themechanistic target of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex 1(mTORC1)和mTOR complex 2(mTORC2).mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。实验结果表明:1)用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nM AZD8055 处理 12h,100nM AZD8055 处理 24h,200nM AZD8055 处理 12h和200 nM AZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200 nM处理24 h组效果最显著(p0.05);Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p0.05);ELISA结果显示对照组细胞培养液中的 TG、PA 和 DHA 含量分别为 19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和 258.75 ±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055 处理 24 h 组细胞培养液中 TG、PA 和DHA 含量分别为 16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml 和 188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61mmol/L、19.54±1.53ng/ml 和 183.82±26.94pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p0.05);2)利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为 5.42±0.08mmol/L、2.74±0.13ng/ml 和 403.3±11.17pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8 h组细胞培养液中 TG、PA 和 DHA 含量分别为 4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml 和297.82±20.8pg/ml,细胞内 31 种脂肪酸总量 2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(P0.05);3)靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为 8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml 和 527.99±32.67 pg/ml,Raptor 基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46 ng/ml和331.84±48.02pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p0.05);4)靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14ng/ml 和 109.47±7.46pg/ml,细胞内 31 种脂肪酸总量 3070.54±105.07 mg/kg;Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24 mmol/L、6.93±0.14 ng/ml 和 55.74±6.01 pg/ml,细胞内 31 种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(b0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(P0.05);5)三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA 抑制率,对 TG 和 DHA 作用 mTORC2mTORC1,对 PA 作用 mTORC1mTORC2.综上所述,mTORC1和mTORC2均在奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯和脂肪酸合成中发挥作用。利用不同的方法对比分析mTORC1和mTORC2的作用强度,mTORC2的作用可能强于mTORC1。由于mTORC1和mTORC2两条信号通路具有"串话(cross talking)"机制,二者在乳脂合成中的协调机制还有待进一步的研究。
[Abstract]:In this study , mTORC1 and mTORC2 were used to study the activity of mTORC1 and mTORC2 . mTORC1 and mTORC2 were used to detect the activity of mTORC1 and mTORC2 . 1 ) After treated with AZD8055 , MTT assay showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 卤 2.61mmol / L , 28.89 卤 1.59ng / ml and 188.63 卤 14.57 pg / ml and 188.63 卤 14.57 pg / ml and 188.63 卤 14.57 pg / ml , respectively . The results showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 卤 2.61mmol / L , 19.54 卤 1.53ng / ml and 183.82 卤 26.94pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA in the culture fluid of treated group were 4.53 卤 0.13 mmol / L , 2.74 卤 0.13ng / ml and 297.82 卤 20.8pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA were 2.49 卤 0.24 mmol / L , 6.93 卤 0.14 ng / ml and 55.74 卤 6.01 pg / ml , respectively .
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

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