香猪睾丸microRNA鉴定及生物学功能分析

发布时间：2018-09-14 09:25

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类重要的非编码小RNA,在靶基因转录后水平调控基因的表达,具有明显的阶段性和组织特异性,在动物各个发育阶段的生长发育和繁殖过程中起作用。香猪作为贵州地方猪品种的优秀代表,性成熟早,产仔数少,目前香猪的繁殖调控机理不完全清楚。本文采用组织学切片技术研究不同月龄香猪睾丸的显微结构,构建四个月龄香猪睾丸组织小RNA c DNA文库,通过HiSeq高通量测序技术,结合生物信息学分析,鉴定出香猪不同发育期miRNA的表达谱,分析差异表达的miRNA分子类型和结构,推测miRNA作用的靶基因和功能,选择6个差异表达的miRNA,研究在不同发育时期睾丸以及其它组织的表达量变化,获得的主要结果如下:1、香猪睾丸的发育特点是4月龄时可检测到成熟精子。2、利用HiSeq高通量测序技术,获得香猪2月龄、3月龄、7月龄和18月龄microRNA表达谱,每个表达谱的高质量micro RNA序列接近600万条。3、从2月龄香猪睾丸RNA文库中鉴定出254个已知miRNA和180个候选mi RNA;3月龄文库鉴定出251个已知mi RNA和176个候选miRNA;7月龄文库鉴定了227个已知miRNA和120个候选miRNA;18月龄文库鉴定215个已知mi RNA和100个候选miRNA。随机选择6个miRNA分子采用实时荧光定量PCR方法证实在相应月龄的睾丸组织中都有表达。4、找到1165种miRNA在四个时期睾丸文库中的表达量有显著差异,其中2月龄文库中有74个miRNA的表达量显著低于3月龄文库;2月龄文库miRNA的表达量显著高于7月龄文库和18月龄文库,分别有219个和224个miRNAs的表达量上调。3月龄文库miRNA的表达量显著高于7月龄文库和18月龄文库,分别有268个和272个miRNAs的表达量上调。7月龄文库miRNA的表达量显著高于18月龄文库,有21个miRNAs的表达量上调。2月龄香猪睾丸中的miRNA表达量最高,18月龄中的表达量最低。5、使用mirecord软件对10种差异表达的miRNA的靶基因进行预测,共得到1953个靶基因,经KEGG Pathway分析,这些靶基因可能参与香猪睾丸的发育和精子的发生过程。6、经实时定量RT-PCR检测,6个mi RNAs在不同发育时期的睾丸组织中均表达,总体趋势是,随着香猪睾丸从1月龄增加到7月龄,Let-7a-5p和miR-10的表达量先升高后下降;mi R-202表达量的逐渐降低;mi R-200b表达量先下降后上升;miR-145-5p与miR-199a-3p的表达量没有明显规律。本文对香猪不同月龄睾丸组织中差异表达的miRNA进行了系统的研究,有助于解析香猪睾丸发育的分子调控机制。
[Abstract]:MicroRNA (miRNA) is a kind of important non-coding small RNA, which regulates the expression of genes at the post-transcriptional level of target genes. It has obvious phase and tissue specificity and plays an important role in the growth and reproduction of animals at various stages of development. As an excellent representative of Guizhou local pig breeds, Xiang pig has early sexual maturity and low litter size. At present, the reproductive regulation mechanism of Xiang pig is not completely clear. In this paper, the microstructures of testis of fragrant pigs at different months of age were studied by histological section technique, and the small RNA c DNA library of testicular tissue of four-month-old Xiang pigs was constructed. HiSeq high-throughput sequencing technique and bioinformatics analysis were used to analyze the microstructures of testis. The expression profiles of miRNA in different developmental stages of Xiang pig were identified. The molecular types and structures of miRNA were analyzed, and the target genes and functions of miRNA were speculated. Six differentially expressed miRNA, studies were selected to study the changes of expression levels in testis and other tissues at different developmental stages. The main results were as follows: 1. The characteristics of testicular development in Xiang pigs were that mature spermatozoa could be detected at the age of 4 months. Using HiSeq high-throughput sequencing technique, the microRNA expression profiles were obtained at the age of 2 months, 3 months old, 7 months and 18 months, respectively. The high quality micro RNA sequence of each expression profile was close to 6 million. 254 known miRNA and 180 candidate mi RNA;3 month-old libraries were identified from 2-month-old Xiangxiang pig testicular RNA library. 251 known mi RNA and 176 candidate miRNA;7 month-old libraries were identified. 227 known miRNA and 120 candidate miRNA;18 month-old libraries were identified for 215 known mi RNA and 100 candidate miRNA.. Six miRNA molecules were randomly selected and confirmed to be expressed in testis tissues of corresponding months by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that there were significant differences in the expression of 1165 kinds of miRNA in testis library in four periods. 74 miRNA expression levels in 2-month-old libraries were significantly lower than those in 3-month-old libraries and 2-month-old libraries, and the expression levels of miRNA in 2-month-old libraries were significantly higher than those in 7-month-old libraries and 18-month-old libraries. 219 and 224 miRNAs up-regulated the expression of miRNA in three-month-old library compared with 7-month-old library and 18-month-old library, respectively. 268 and 272 miRNAs expression levels were significantly higher than that of 18-month-old library, respectively, and the expression of miRNA in 7-month-old library was significantly higher than that in 18-month-old library. The expression of miRNA in the testis of 21 miRNAs was the highest and the lowest among 18 months of age. The target genes of 10 differentially expressed miRNA were predicted by mirecord software. A total of 1953 target genes were obtained by KEGG Pathway analysis. These target genes may be involved in testicular development and spermatogenesis of Xiang pig. By real-time quantitative RT-PCR detection, 6 mi RNAs were expressed in testicular tissues of different developmental stages, and the general trend was: With the increase of testis from 1 month to 7 months, the expression of Let-7a-5p and miR-10 increased first, then decreased gradually. The expression of miR-200b decreased first and then increased. There was no obvious regularity in the expression of miR-145-5p and miR-199a-3p. In this paper, the differential expression of miRNA in the testis of Xiang pig at different ages was systematically studied, which was helpful to explain the molecular regulation mechanism of testicular development in Xiang pig.
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

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本文编号：2242299