三种猪病毒性腹泻病原检测方法和PEDV间接ELISA方法的建立与初步应用

发布时间：2021-04-25 20:42

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)、猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)、猪轮状病毒病(Porcine rotavirus disease,RVD)是猪场常见的病毒性腹泻,分别由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(Porcine rotavirus,RV)引起的,给养猪业造成了巨大的经济损失。三种病毒引起的腹泻具有类似的传染途径和临床症状,感染猪临床均表现为水样腹泻、呕吐、脱水及新生仔猪的高死亡率,三者流行病学和病理剖检也极其相似,但三种病原没有共同的抗原性,不能交互免疫,而又有混合感染,也易继发其他细菌性感染,导致仔猪死亡率升高或生长缓慢。目前,常规的诊断方法如病毒分离、血清学诊断方法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷,已不能满足现实临床诊断需要。多重PCR方法具有敏感性高且可以一次检测多种病原的优势,更适于混合感染的快速诊断。在临床检测时发现进行了免疫的猪群会出现PED现象,为了检测山东省猪场PEDV免疫水平,对免疫猪进行抗体检测,免疫后的抗体的跟踪检测,建立了针对S基因主要抗原表位的原核表达,并利用S90蛋白建立了间接ELISA方法。本研究共分为3部分:1.PEDV-TGEV-RV多重PCR方法建立本文进行了PEDV、TGEV和RV多重RT-PCR检测方法的研究。根据近几年来山东主要流行株PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分别设计了特异性引物,分别扩增出预期的311bp、763bp和516bp的目的片段,成功建立同时检测猪三种常见病毒感染的多重PCR方法。通过敏感性和特异性的试验,发现本方法对PEDV的最高敏感度为30pg,TGEV的最高敏感度为18pg,RV的最高敏感度为42pg,并通过对其他常见几种病原进行PCR扩增,发现本方法特异性良好,可以应用于临床样品检测。利用该检测方法对2015年到2016年来自山东省济南、泰安、莱芜等发病猪场的412份临床病料进行检测,结果表明PEDV、TGEV和RV的阳性率分别为22.3%、7.28%和1.46%,PEDV与TGEV、PEDV与RV、TGEV与RV双重混合感染阳性率分别为5.34%、1.94%和2.91%,PEDV、TEGV和RV三重感染阳性率为4.85%。同时用文献报道的单一RT-PCR法对以上样品进行检测,结果符合率为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较敏感度和特异性,可用于临床PEDV、TGEV和RV的检测。2.PEDV S90基因的原核表达与条件优化本试验设计一对引物,以PEDV山东流行毒株为扩增模板,扩增了PEDV的S基因的主要抗原表位区,并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建了重组表达质粒,导入表达菌E.coli BL21(DE3),通过对表达时间,诱导剂的使用量等条件的摸索,使构建的pET32a-S90质粒在宿主菌中大量稳定的进行蛋白表达,通过对优化条件的摸索得出:最佳的表达条件诱导剂IPTG终浓度为1mmol/mL的,37℃,220rpm,诱导表达6h时蛋白表达量最大。经过对菌体蛋白纯化获得纯度较高的目的蛋白,Western blot检测表明,表达的重组S90蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,不与其他常见猪病阳性血清发生反应,说明该蛋白具有一定的反应原性。3.PEDV间接ELISA方法的建立和初步应用利用纯化的原核表达S90蛋白为包被抗原,建立了检测猪体内PEDV抗体的间接ELISA方法。优化条件为S90蛋白最佳包被量为2μg/mL,4℃孵育过夜,最佳包被液为5%脱脂奶粉,被检血清最佳稀释度为1:100,抗体最佳反应时间为37℃2h,二抗按1:4000稀释,37℃1.5h,显色液的最佳终止时间为室温15min,阳性的Cut-off值为0.204。以建立的间接ELISA方法对采山东省莱芜2个未免疫猪场120头猪进行抗体检测,总体检测抗体为54.15%,其中母猪感染抗体阳性率为60%,育成猪抗体阳性率为48.3%,抗体阳性率不高,存在严重的野毒现象。对山东省济南三个免疫猪场195头猪进行抗体检测和免疫后抗体跟踪,检测结果显示,检测的血清中PEDV抗体的总阳性率为70.3%,其中母猪血清PEDV抗体阳性率为64.8%,育成猪血清PEDV抗体阳性率为76.7%。跟踪检测猪场免疫后抗体水平消长规律,7d抗体开始上升,28d达到最高。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28

文章目录

中文摘要

Abstract

前言

1.1 猪流行性腹泻病毒

1.1.1 PEDV概述

1.1.2 PEDV的分子生物学特性

1.1.3 临床症状及病理变化

1.1.4 PEDV检测方法研究进展

1.2 猪传染性胃肠炎病毒

1.2.1 TGEV概述

1.2.2 TGEV基因组成

1.2.3 TGE临床症状及病理变化

1.2.4 TGEV检测方法的研究进展

1.3 猪轮状病毒

1.3.1 RV概括

1.3.2 RV的病毒形态

1.3.3 轮状病毒分类

1.3.4 轮状病毒检测方法

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株与疫苗

2.1.2 菌种和质粒

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 试验中配制的试剂

2.2 方法

2.2.1 PEDV-TGEV-RV单一PCR方法的建立

2.2.2 PEDV-TGEV-RV多重PCR检测方法的建立与临床样品检测分析

2.2.3 PEDV S90蛋白表达与条件优化

2.2.4 PEDV S90间接ELISA检测方法的建立与应用

3 结果与分析

3.1 PEDV、TGEV和RV单一PCR方法的建立

3.1.1 检测引物的PCR扩增

3.1.2 阳性质粒的双酶切鉴定结果

3.1.3 PCR反应条件的优化

3.1.4 单一PCR体系及反应程序的确立

3.1.5 阳性克隆序列测定

3.2 PEDV-TGEV-RV多重PCR检测方法的建立与临床样品检测分析

3.2.1 多重PCR方法的建立

3.2.2 多重PCR反应的特异性

3.2.3 多重PCR反应的灵敏性

3.2.4 多重PCR的重复性试验

3.2.5 样品检测结果

3.3 PEDV S90蛋白表达结果

3.3.1 目的基因RT-PCR扩增

3.3.2 原核重组表达质粒的构建

3.3.3 重组表达质粒阳性的鉴定

3.3.4 阳性克隆序列测定

3.3.5 SDS-PAGE分析

3.3.6 诱导表达条件优化

3.3.7 目的蛋白的纯化

3.3.8 Western blot鉴定分析

3.4 间接ELISA检测方法的建立

3.4.1 蛋白浓度测定

3.4.2 抗原最适合包被浓度和抗体最佳稀释度的确定

3.4.3 封闭液的确定

3.4.4 最优封闭时间选择

3.4.5 最佳血清孵育时间的确定

3.4.6 二抗最佳稀释度选择

3.4.7 底物最佳反应时间的确定

3.4.8 间接ELISA方法的判断标准的确定

3.4.9 特异性检验

3.4.10 重复性实验结果

3.4.11 符合性检验

3.4.12 临床样品检测

4 讨论

4.1 PCR方法建立与临床检测

4.2 PEDV S90蛋白的原核表达与条件优化

4.3 PEDV S90间接ELISA的研究

5 结论

6 参考文献

7 致谢

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