【摘要】：猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病,病毒的基因组为分节段的单股负链RNA,这一特点使病毒能通过基因突变和基因重配不断进化,从而逃避宿主的免疫压力。探究机体感染猪流感病毒后的天然免疫变化和宿主蛋白的抗病毒作用具有重要的理论意义。1.猪流感病毒感染对猪肺泡巨噬细胞天然免疫信号通路的影响从35日龄健康仔猪肺部分离肺泡巨噬细胞,以MOI=5感染H3N2猪流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005,间接免疫荧光试验发现猪流感病毒能够在猪原代肺泡巨噬细胞中增殖。荧光定量RT-PCR方法检测结果显示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA在感染后6-24h均出现显著升高(p0.05);IRF-7、IFN-β的mRNA在感染后8-24h显著升高(p0.05);MyD88和MAVS mRNA在感染后8h升高,12h后又开始缓慢下降。放射性免疫方法检测上清中细胞因子的含量,其中IL-1β、TNF-α分别在感染后6h和8h出现峰值;IFN-α及IFN-β在病毒感染6-8h后显著升高,至24h时仍维持较高水平(p0.05)。结果表明,该猪流感病毒毒株能够在猪肺泡巨噬细胞中有效增殖,且能激活TLR及RLR信号通路中相关受体及效应因子的基因与蛋白表达。2.猪流感病毒感染对上皮细胞系A549天然免疫信号通路的影响人肺癌上皮细胞系A549以MOI=5感染H3N2猪流感病毒,结果发现猪流感病毒能够在A549细胞上有效增殖,感染后48h,毒价可达106.1TCID50/mL。荧光定量RT-PCR检测结果显示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA水平在感染后6h均开始显著升高(p0.05)。IRF-7、IFN-α及IFN-βmRNA在感染后8-24h显著升高(p0.05)。MyD88和MAVS mRNA在8h时升高,12h后又开始缓慢下降,至24h时与对照组无显著差异(p0.05)。Western blot分析发现RIG-Ⅰ、TLR-3、TLR-7等蛋白表达水平在病毒感染后升高,而MAVS在感染后降低。此外,双荧光素酶报告试验发现polyⅠ:C刺激或SIV感染后,能显著诱导IFN-β启动子、IRF3/7结合位点、NF-κB结合位点报告质粒的荧光素酶表达。结果表明,该猪流感病毒毒株能够在A549细胞中增殖,且能够有效激活TLR及RLR介导的天然免疫信号通路。A549细胞系可以作为研究猪流感病毒感染后宿主细胞天然免疫变化的体外细胞模型。3.MAVS通过介导IFN-Ⅰ的产生抑制猪流感病毒的增殖在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS质粒的基础上构建各种MAVS截断突变质粒,通过过表达试验发现MAVS能显著激活IFN-β启动子活性,进而抑制病毒的增殖,且呈剂量依赖性。当缺失CARD结构或者跨膜区时,MAVS几乎不能诱导IFN-β启动子或NF-κB、IRF-3/7结合位点的活化,且对病毒滴度几乎无抑制效果;缺失脯氨酸富集区的突变质粒对其功能的影响不显著,但其活性低于完整的MAVS(p0.05)。表明CARD结构或跨膜区对MAVS介导的IFN-I的产生至关重要。通过人工合成的siRNA序列抑制A549细胞的内源性MAVS表达,再次感染猪流感病毒,结果发现病毒诱导的IFN-β启动子的活化受到显著抑制,病毒滴度显著升高(p0.05),表明MAVS对宿主细胞IFN-Ⅰ抗病毒通路的活化是必需的,提示线粒体可能在宿主的天然免疫通路中发挥重要作用。4.MAVS介导病毒引起的细胞凋亡在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS质粒的基础上构建各种MAVS截断突变质粒，，通过过表达试验发现MAVS能显著促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性(p0.05)。Western blot检测发现,在MAVS过表达细胞中,Caspase-9、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水平显著升高(p0.05)。缺失CARD结构或跨膜区时,凋亡比率显著降低(p0.05),而缺失脯氨酸富集区对细胞凋亡的影响不显著(p0.05)。通过特异性siRNA抑制细胞内源性MAVS的表达后,再次感染猪流感病毒,结果发现病毒感染引起的细胞凋亡比率显著下降(p0.05),表明MAVS对猪流感病毒感染导致的细胞凋亡的发生是必不可少的。通过Transwell小室试验发现转染MAVS能引起凋亡细胞比例显著升高,而处于同样培养环境的对照转染细胞未出现细胞凋亡,表明MAVS介导的凋亡不是IFN-Ⅰ的副效应,与IFN-Ⅰ的产生是独立发挥作用的。研究提示,MAVS介导的凋亡途径在宿主抗病毒感染中可能发挥着重要的作用。5.猪流感病毒相关蛋白对MAVS介导的IFN-Ⅰ产生及凋亡的影响将猪流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005(H3N2)的NS1、PB1-F2及NP表达质粒,分别与MAVS全长表达质粒共转染A549细胞,通过双荧光素酶报告系统研究发现NS1、PB1-F2能显著降低MAVS诱导的IFN-β启动子活性(p0.05),且NS1抑制MAVS介导的IFN-β启动子的活性呈剂量依赖性;流式细胞术检测结果显示NS1蛋白能显著拮抗MAVS介导的凋亡的产生,并呈显著的剂量依赖性(p0.05),而PB1-F2、NP蛋白对MAVS介导的凋亡的抑制作用不显著(p0.05);MAVS过表达能显著抑制病毒的增殖,共表达NS1质粒后,病毒滴度显著升高(p0.05);共表达PB1-F2、NP质粒也能引起病毒滴度的升高,但差异不显著(p0.05)。研究结果表明,NS1能够拮抗MAVS介导的IFN-Ⅰ产生及细胞凋亡,为深入认识猪流感病毒逃避宿主细胞天然免疫监视的机制提供了新的理论依据。综上可见,猪流感病毒感染能有效激活宿主细胞TLR及RLR介导的天然免疫信号通路,且RLR通路中的关键接头蛋白MAVS在IFN-Ⅰ产生及细胞凋亡中发挥重要作用。同时,猪流感病毒的NS1蛋白能显著拮抗MAVS介导的IFN-Ⅰ及凋亡的产生。这为深入研究宿主识别和清除病毒感染及病毒逃避宿主免疫系统的分子机制提供了新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
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本文编号：
2259477
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