猪繁殖与呼吸综合征病毒入胞信号传导分子机制研究
发布时间：2018-10-13 17:54
【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种有V⒛さ恼碦NA病毒。它属于动脉炎病毒科,尼多病毒目。PRRSV感染能够导致仔猪、育肥猪急性呼吸困难,妊娠母猪繁殖障碍,给全世界的养猪业造成了巨大的损失。尽管多年以来人们对PRRSV致病机理进行了深入的研究,并发现了许多有重要意义的成果,但是这些研究主要针对于PRRSV引起宿主免疫反应的机制。我们对于PRRSV的增殖机制如病毒的复制,入胞,组装,释放机制了解的还很有限。本研究主要针对PRRSV入胞过程中诱导细胞激活的信号通路及其分子机制进行了深入探讨,系统分析了PRRSV入胞的分子机制。主要研究内容包括:1 FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路参与PRRSV入胞过程运用Western Blot技术,激光共聚焦技术,荧光定量PCR技术我们对PRRSV(JXA1)株在进入MARC-145细胞及PAM细胞过程中激活的信号分子进行了分析。结果表明,PRRSV在进入细胞过程中可以激活FAK,PI3K,AKT,Rac1信号分子,并且可以重构细胞微丝骨架,诱导细胞产生片状伪足。我们利用信号分子的特异性抑制剂来验证它们在信号通路中的上下游关系,FAK的特异性抑制剂PF573228可以抑制PI3K,AKT,Rac1信号分子激活,PI3K的特异性抑制剂LY294002可以抑制AKT与Rac1激活。对细胞瞬时转染Rac1持续性激活表达质粒可以拮抗AKT抑制剂对病毒入胞的影响。进一步研究表明FAK,PI3K,AKT,Rac1的特异性抑制剂都可以抑制病毒入胞。所以我们的实验证明了病毒的入胞过程会激活FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路,并且PRRSV入胞过程需FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路激活。2、整合素αv亚基可以将信号传递给FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路我们对PRRSV进入MARC-145细胞过程中整合素亚基的分布,及作用进行了分析。结果表明,PRRSV在进入细胞过程中可以使整合素αv亚基进行重新分布,并且病毒粒子在入胞过程中与αv亚基共定位。在病毒入胞过程中无法与整合素β1亚基共定位,也无法使β1亚基进行重新分布。所以整合素αv亚基在病毒入胞过程中可能会起作用。通过实验我们发现,整合素αv亚基中和抗体可以抑制病毒入胞,用RNA干扰技术特异性干扰整合素αv亚基以后病毒入胞水平降低。为验证整合素αv亚基在信号通路传导中的作用,我们利用αv亚基中和抗体和RNA干扰来处理细胞,结果表明抑制αv亚基的功能可以显著抑制FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路。在干扰αv亚基以后补加下游信号分子PI3K的激活剂可以使病毒入胞水平回升。而整合素的激活剂Mn~(2+)可以促进病毒粒子入胞,并且可以促进信号通路激活。为验证脂筏在αv亚基传导信号过程中的作用,利用激光共聚焦等方法我们发现,在PRRSV入胞过程中整合素αv亚基会转移到脂筏中,并且脂筏的完整性对于信号通路的传导都是必须的。以上实验结果表明在病毒入胞过程中,整合素αv亚基可以脂筏中将信号传递给FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路,从而促进病毒入胞。3、细胞内ROS、Ca~(2+)参与PRRSV入胞和信号转导过程运用流式细胞术等方法我们对PRRSV(JXA1株)在进入MARC-145细胞过程中激活的细胞内产生的活性氧(ROS)进行定量分析,结果表明,PRRSV(JXA1株)在进入细胞过程中可以刺激细胞产生ROS。通过Western Blot技术,荧光定量PCR技术,我们对ROS的作用进行了分析。结果表明,ROS的特异性清除剂NAC可以抑制病毒入胞,另外NAC可以抑制病毒在入胞过程中激活的FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路。TLR4的特异性抑制剂TAK242可以抑制由病毒入胞诱导的ROS,并且TAK242同样可以抑制病毒入胞与信号通路激活。除此之外,细胞内Ca~(2+)的螯合剂BAPTA-AM也能够抑制PRRSV入胞与信号通路转导。这些实验表明细胞内的ROS与Ca~(2+)参与病毒入胞与信号转导过程。4、PRRSV可能通过结构蛋白GP3上的RHD基序与整合素结合整合素需要通过配体上的特定序列与之相结合,根据已经报道结合肽的基序,我们在PRRSV的结构蛋白GP3上找到了基序RHD,在GP2a上找到了LDV序列。因此PRRSV可能会通过这些基序与整合素相结合,从而促进自身的入胞。实验结果表明RHD肽可以特异性地抑制病毒入胞但并不影响病毒吸附,另外RHD肽可以抑制FAK-PI3K-AKT-Rac1信号通路。以上实验表明PRRSV可能是通过GP3上的RHD序列与整合素相结合从而促进自身入胞。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
，
本文编号：2269442
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
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