兔出血症病毒RPA检测方法的建立及间接ELISA检测抗体的研究

发布时间：2018-10-16 21:49

【摘要】：兔病毒性出血症(viral haemorrhagic disease of rabbits)是由兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)感染所引起的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、高致死性的传染性疾病,以全身实质器官出现水肿、淤血和出血为主要特征。RHDV被分为G1~G5以及G6(RHDVa,又名RHDV抗原变异株)6种基因型。2010年首次报道了变异型RHDV,它在遗传特性上与RHDV的6个基因型有很大的差异,命名为RHDV2也称为RHDVb。在欧洲野兔体内,发现一个能引起野兔发病的新型毒株与RHDV的基因组结构类似,被称为欧洲褐色兔综合症病毒(EBHSV)。本试验利用RHDV病原建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测方法,通过生物信息学分析,将RHDV的VP60基因进行分段表达确定其抗原性,以此建立了间接ELISA方法。本研究主要包括以下四部分内容:1 RHDV毒株的分离与分子遗传变异特性分析在山东不同地区分离了3株RHDV毒株,分别命名为BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株,克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因,通过VP60核酸序列进化树分析显示,3个毒株均属G6(RHDVa)变异群,序列同源性比对分析显示,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中其它经典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分别在90.2%~98.6%、90.5%~99.9%、89.4%~99.5%,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株与Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分别在82.6%~82.9%、82.5%~82.8%、81.5%~81.9%。2014年河北分离到HB毒株与1984年江苏首次分离的WX84毒株遗传距离很近,推测其很可能来自毒株WX84株,近几年,中国从西北、华东、东北和西南四大地区分离到的具有代表性的RHDV毒株与WX84株差异较大,说明RHDV发生了变异,但是四大地区之间的RHDV毒株差异不大,且同世界其他国家和地区RHDV分离株基因序列几乎没有差异,同源性达到90%以上,因此,病毒基因型和流行的地域性没有必然联系。2 RPA检测方法的建立根据BZ/2015株的VP60基因的核酸序列,设计1对特异性引物,优化反应条件,建立了RHDV重组酶聚合酶等温扩增检测方法。通过敏感性、特异性、人工感染和临床应用等表明,该方法能特异扩增出特异片段,检测灵敏度达到0.1 LD50,与常规一步法RT-PCR敏感性相同。该方法具有较好的稳定性、敏感性和特异性。重组酶聚合酶等温扩增反应过程总耗时30 min左右,RPA检测方法和一步法RT-PCR的检出符合率为100%。3 VP60基因分段表达及抗原性分析VP60基因分为3个区域VP60-1(2aa-208aa)、VP60-2(174aa-425aa)和VP60-3(342aa-579aa)。VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分别克隆到原核表达载体pET32a(+)和pColdⅢ中,4个重组质粒分别命名为pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。对VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因进行IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60条带大小,与预期大小一致。将表达的重组蛋白纯化后的蛋白进行Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV阳性血清发生特异性反应。4 ELISA方法建立利用纯化的VP60分段蛋白作为包被抗原,以兔出血症病毒阳性血清为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗建立间接ELISA检测方法。分别用ELISA方法和HI试验对7只6周龄SPF兔免疫RHD灭活疫苗后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d的抗体水平进行检测,间接ELISA结果显示,重组蛋白VP60-1和VP60作为包被抗原检测兔免疫后血清中的抗体消长规律一致。HI试验和以VP60-1作为包被抗原的间接ELISA试验检测结果一致,本试验根据两种方法所测得的各组兔群的抗体效价建立了相应的回归方程r2=0.9547,表明ELISA方法与HI试验检测的抗体效价结果呈显著相关性。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

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