【摘要】：杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是存在于人和哺乳动物多形核粒细胞内的一种阳离子抗菌蛋白,BPI蛋白能够特异性杀伤革兰氏阴性菌并中和内毒素,同时,具有免疫调节、诱导内皮细胞凋亡、抗真菌、抗弓形虫感染等生物学功能。目的:本研究以新疆巴什拜羊及杂交羊(盘羊♂×巴什拜羊♀)为研究对象,应用分子生物学技术克隆BPI N-端序列,并在巴斯德毕赤酵母中表达出43KD的含有199个氨基酸的重组BPI蛋白(recombinant bectericidal/permeability increasing protein,r BPI),利用Ni2+螯合亲和层析法纯化后通过抑菌试验、凋亡诱导试验、抑制支原体试验、比较巴什拜羊及杂交羊之间BPIm RNA表达水平的差异,以揭示BPI蛋白的体外生物学功能。方法:(1)巴什拜羊及其杂交羊BPI基因的克隆与真核表达:从巴什拜羊及其杂交羊外周血多形核粒细胞(Peripheral blood polymorphonuclear neutrophils,PMN)中提取总RNA,经RT-PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆至p PIC9K载体中,构建真核表达质粒p PIC9K-BPI,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中,并用0.5%甲醇对重组菌株GS115/p PIC9K-BPI进行诱导表达,最后用SDS-PAGE鉴定r BPI的表达。(2)巴什拜羊及杂交羊BPI基因表达产物的纯化:为了获得纯度较高的巴什拜羊及其杂交羊的r BPI,对巴什拜羊及其杂交羊r BPI采用Ni2+螯合亲和层析法进行纯化,再用SDS-PAGE对纯化产物进行检测。(3)巴什拜羊及杂交羊r BPI的抑菌作用:将巴什拜羊及杂交羊r BPI分别加入大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中,利用微量肉汤稀释法检测巴什拜羊及杂交羊r BPI对三种致病菌的抑制作用。(4)巴什拜羊及杂交羊r BPI对小鼠脑内皮细胞凋亡的影响:在体外培养的小鼠脑内皮细胞(mouse brain endothelial cells,MBECs)中加入巴什拜羊及杂交羊r BPI,利用Annexin V FITC/PI染色法在荧光显微镜下鉴定凋亡细胞,并通过细胞计数法检测凋亡率;再用凋亡试剂盒提取凋亡细胞的DNA,通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA ladder。(5)巴什拜羊及杂交羊r BPI对体外绵羊肺炎支原体感染的影响:向体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)中加入巴什拜羊及杂交羊r BPI,利用real-time PCR技术检测MO 16S r RNA的表达水平。(6)巴什拜羊及杂交羊中性粒细胞体外表达BPI m RNA水平的检测:分别在体外分离培养巴什拜羊及其杂交羊的中性粒细胞,加入MO进行感染,利用real-time PCR技术检测巴什拜羊及其杂交羊中性粒细胞表达BPI m RNA水平的差异。结果与结论:(1)成功构建了巴什拜羊及杂交羊BPI的真核表达载体,并且在巴斯德毕赤酵母中成功表达了分子量为43KD的巴什拜羊及杂交羊r BPI。(2)巴什拜羊及杂交羊BPI表达纯化产物经SDS-PAGE电泳后,观察到较为单一的目的条带,成功纯化了巴什拜羊及其杂交羊的r BPI。(3)抑菌试验结果表明,巴什拜羊r BPI的浓度在20μg/ml以上即可抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长,杂交羊r BPI的浓度在40μg/ml以上时能抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长,表明巴什拜羊r BPI的抑菌效果较杂交羊r BPI的抑菌效果强,但均对G+无明显效果。(4)Annexin V FITC/PI染色法可检测到巴什拜羊r BPI浓度为540nmol/L(凋亡率为30.42%)、250nmol/L(凋亡率为20.46%)和180nmol/L(凋亡率为14.68%)与对照组(凋亡率3.19%)相比差异极显著(P0.01,P0.01,P0.01),在540nmol/L的巴什拜羊r BPI诱导作用下可见清晰的DNA ladder条带;杂交羊r BPI浓度为540nmol/L(凋亡率为14.76%)、250nmol/L(凋亡率为11.03%)与对照组(凋亡率3.06%)相比差异显著(P0.05,P0.05)。(5)巴什拜羊r BPI(0.46和0.23mg/ml)在作用4h时MO 16S r RNA表达水平显著低于对照组(p0.05),而杂交羊组的肺炎支原体的16S r RNA表达水平与对照组差异不显著。说明巴什拜羊的r BPI对绵羊肺炎支原体可起到抑制作用,而杂交羊的r BPI对绵羊肺炎支原体无明显抑制作用。(6)在MO感染后4h至8h,巴什拜羊试验组的中性粒细胞BPI m RNA表达水平显著高于巴什拜羊对照组和杂交羊试验组(P0.05,P0.05),说明MO的感染能够显著提高巴什拜羊中性粒细胞表达BPI m RNA的水平,而杂交羊中性粒表达BPI m RNA水平上升不明显。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【参考文献】
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