鼻气管鸟杆菌分离鉴定与OMA87蛋白单克隆抗体制备

发布时间：2018-10-21 08:07

【摘要】：1.肉鸡感染鼻气管鸟杆菌的分离与鉴定从江苏省某白羽肉鸡场出现呼吸道症状的鸡群中分离获得3株病原菌,在绵羊血琼脂上划线,37℃,5%的CO2培养箱中培养48 h后可见灰白色、表面隆起、边缘整齐、圆形有丁酸样气味的菌落,而在麦康凯琼脂上不生长。经革兰氏染色后,在显微镜下可观察到粉红色、短小杆菌(长0.6～1.5μm,宽0.2～0.6μm),单个或呈短丝状排列呈多形性。经负染通过电镜观察未发现有荚膜、鞭毛、菌毛等细菌的特殊结构。用API20NE生化反应试剂盒检测其结果显示,硝酸盐反应、吲哚试验为阴性,葡萄糖、氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶均为阳性。根据GenBank已发表的鼻气管鸟杆菌(Omithobacterium rhinotracheale,ORT)16SrRNA基因序列进行多重比对后设计出一对特异引物,经PCR扩增出 379bp条带。经测序后其基因序列与GenBank已发表的ORT基因序列进行比较结果显示,同源性均在99.4%以上,表明该扩增片段为鼻气管鸟杆菌的特异片段。2.鼻气管鸟杆菌OMA87蛋白原核表达及抗原性鉴定通过参考 GenBank 中 ORT-DSM 15997 株基因序列(GenBank:CP003283.1),设计了覆盖全部ORTOMA87编码区(第32322至第34886位碱基)的特异性引物,使用PCR方法将其扩增并插入pMD 18-T Vector中进行克隆。测序正确后,用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ对重组质粒进行双酶切,并分别将目的片段连接入原核表达载体pGEX-6p-1,提取质粒pGEX-6p-1-OMA87,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。分析发现,融合蛋白GST-OMA87(121KD)在上清和沉淀中均有表达。将上清中的蛋白纯化、浓缩后,用ORT阳性SPF鸡血清作为一抗,兔抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot验证,结果显示融合蛋白GST-OMA87可与SPF鸡ORT阳性血清发生反应,具有较好的抗原性,说明此融合蛋白可用作制备针对ORT单克隆抗体。3.鼻气管鸟杆菌OMA87蛋白的单克隆抗体制备利用研究二所得纯化的重组蛋白GST-OMA87作为免疫原,按照常规程序免疫6～8周龄Balb/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接ELISA筛选阳性细胞株,最终获得两株稳定分泌抗重组蛋白OMA87的单克隆抗体细胞株:ORT-OMA87-2C4和ORT-OMA87-5G9;抗体亚类鉴定2C4抗体重链IgG2a,5G9抗体重链为IgG1,轻链均为Kappa型;其腹水抗体效价分别为1:32000、1:64000。经间接ELISA特异性检测结果显示2C4、5G9均能与ORT包被抗原呈阳性反应,且与包被其它几种抗原之间无交叉反应。利用单抗检测分离鉴定的ORT阳性菌株,为进一步建立特异性强、敏感度高、简便快捷的检测方法奠定了基础。
[Abstract]:1. Isolation and identification of avian bacillus rhinotrachea infection in broilers, three strains of pathogenic bacteria were isolated from chickens with respiratory symptoms in a white broiler farm in Jiangsu Province. The strains were underlined in sheep blood Agar. Grayish white was observed in 37 鈩，

本文编号：2284490