莱克多巴胺免疫PCR检测方法学基础研究

发布时间：2018-10-22 14:46

【摘要】：莱克多巴胺(ractopamine,RAC)属于苯乙醇胺类β-受体激动剂,作为动物饲料添加剂,可以提高食用动物的瘦肉转化率。长期或大量喂药后,动物体内的残留会随食物链在人体内蓄积,造成巨大危害,威胁人类健康。目前,欧盟及中国等国家已明确禁止将此物质添加在饲料和动物饮水中。本论文在酶联免疫吸附法(ELISA)的基础上,对实时荧光免疫PCR为和免疫LAMP测定莱克多巴胺的方法进行了研究,获得了以下结果:1、借助多元酸酐法引入羧基制备莱克多巴胺半抗原(RAC-戊二酸酐半醛),后用混合酸酐方法将半抗原同载体蛋白(BSA与OVA)偶联,分别合成了免疫原RAC-BSA和包被原RAC-OVA。采用常规办法免疫新西兰大白兔,获得了良好效价的多克隆抗体anti-RAC p Ab。2、混合酸酐法连接RAC与HRP。利用该酶标抗原与多克隆抗体建立了直接竞争ELISA法,以检测莱克多巴胺残留。结果表明,此方法IC50值为1.1ng/m L,最低检测限(LOD)为0.19ng/m L。此方法对RAC有高特异性,同其他16种β-兴奋剂的交叉反应率均在0.1%以下。实际样品检测时,板内回收率在79%-94%,为可接受范围。板内变异系数在0.9-4.7%间,板间变异系数在3.1-5.1%,证明该方法重复性良好。3、本研究在酶联免疫方法的基础上,用荧光定量PCR作为信号检测手段,建立实时定量免疫PCR法检测RAC。采用PCR引物5’-端标记生物素的方法和N-羟基琥珀酰亚胺活性酯化法分别制备生物素标记DNA及生物素化多克隆抗体。以链霉亲和素和生物素系统为实验基础,完成抗原抗体结合的信号放大。针对反应的主要参数,包括反应载体、标记抗体与抗原的浓度、亲和素浓度、洗板次数、Bio-DNA浓度等因素进行优化,最终建立rt-IPCR反应体系:选用戊二醛0.6%处理PCR管反应,以2μg/m L检测抗原进行包被,加入0.326μg/m L生物素化抗体进行反应后,选择浓度为2.57μg/m L亲和素将生物素抗体与0.35ng的Bio-DNA结合起来,最终用PBST与dd H2O分别洗涤5次。经检测,该方法的最低检测限(LOD)为0.0039ng/m L,IC50=0.18ng/m L。与竞争ELISA方法相比,提高了两个数量级。该方法中,RAC-多克隆抗体对RAC有很高的特异性,与其他16种β-受体激动剂物质没有交叉反应(CR0.018%)。添加回收实验结果表明,在RAC浓度为0.25-1.0ng/m L时,板内回收率在80-120%,板内及板间变异系数(CV%)小于10%。4、选择合成的生物素化DNA设计LAMP引物,对LAMP反应体系进行优化,确定反应体系为:0.2mmol/外引物(F3/B3),1.6mmol/L内引物(FIP/BIP),1.4mmol/Ld NTPs,0.6MBetaine,8mmol/LMg SO4,10mmol/LKCl,20mmol/LTris-HCl,10mmol/L(NH4)2SO4,0.1%Tween 20,8U Bst DNA Polymerase,200?mol/L Calcein,500?mol/L Mn Cl2,template 2.5?L,dd H2O补足25μL。实验结果通过SYBR Green荧光通道采用荧光定量PCR仪检测。以梯度稀释的Bio-DNA为模板,测得可视化LAMP检测法的灵敏度为1.0×104 copies/μL。将此方法应用于免疫PCR核酸检测中,最低检测限(LOD)为0.0079ng.m L,IC50=0.41ng/m L。与竞争ELISA方法相比,提高了约一个数量级。该方法中,RAC-多克隆抗体对RAC有很高的特异性,与其他16种β-受体激动剂物质无交叉反应(CR0.04%)。本研究在制备RAC-BSA及RAC-OVA,获得高效价、专一性强的多克隆抗体的基础上,建立了莱克多巴胺的直接竞争ELISA检测法。基于ELISA研究,建立了莱克多巴胺的间接竞争免疫PCR法,对其各项工作指标,如特异性、准确度等进行评价。同时,初步研究了免疫LAMP技术,针对灵敏度及特异性进行评估。
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【学位授予单位】：中国计量学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.84

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