仔猪小肠上皮细胞对β-Conglycinin及其酶解产物吸收规律的研究

发布时间：2018-10-24 10:42

【摘要】：多年来人们通过对大豆抗营养因子的深入的研究,发现多种幼龄动物的屏障功能会受到日粮中大豆抗原蛋白的影响,限制了大豆在动物营养行业的利用率,进而对畜牧业的发展会产生一定的损失。因此本论文利用体外模拟法,选取纯化的β-Conglycinin及其酶解产物作为致敏原,以仔猪空肠上皮细胞为(IPEC-J2)模型,研究不同浓度的β-Conglycinin及其酶解产物作用IPEC-J2不同时间后,检测其跨上皮细胞吸收规律并确定其转运方式,进而通过染料木素和果寡糖来筛选有效的吸收抑制剂的作用浓度。为进一步揭示大豆抗原蛋白的致敏机理奠定理论依据。试验Ⅰ仔猪小肠上皮细胞对大豆抗原蛋白吸收动力学的研究本实验分别用浓度为0、0.25、0.5、1.0 mg/mLβ-Conglycinin及其酶解产物处理IPEC-J2(0、2、4、8、12 h)后,收集Transwell下室的液体以及胞质蛋白,分别用ELISA和Western blot对具有免疫活性的蛋白进行定量和定性分析,将对应的SDS-PAGE电泳条带切胶,用Q-E质谱对三条蛋白质肽段进行鉴定,结果显示,随着β-Conglycinin及其酶解产物浓度的增加,作用时间的延长,具有免疫活性的蛋白数量呈时间-剂量依赖性升高趋势(P0.05),但随着β-Conglycinin刺激浓度的增加及其酶解产作用时间的增加,胞质中的蛋白的含量会出现显著性下降(P0.05)。以上结果表明β-Conglycinin及其酶解产物是通过IPEC-J2胞质后被肠道吸收,即属于内吞的转运方式。为了进一步验证β-Conglycinin及其酶解产物是如何通过IPEC-J2胞质内吞作用,本试验将致敏原β-Conglycinin及其酶解产物稀释成浓度为1 mg/mL后对细胞作用8 h,采用免疫荧光法检测其细胞胞质膜表面是否附着网格蛋白。结果表明:β-Conglycinin及其酶解产物处理后的细胞可见荧光沿细胞胞质面分布,边界清楚,呈网状结构,即属于网格蛋白依赖性内吞的转运方式。试验Ⅱ仔猪肠上皮细胞对大豆抗原吸收抑制物的筛选本实验将仔猪肠上皮细胞接种在Transwell上,在浓度为1.0 mg/mL的β-Conglycinin及其酶解产物的培养基中分别加入浓度为(0、6、12、18、24μg/mL)染料木素和(0、3、6、9、12μg/mL)果寡糖处理IPEC-J2 8 h后,分别收集Transwell下室的液体以及胞质蛋白,利用ELISA和Western blot对具有免疫活性的蛋白进行定量和定性分析。结果表明:添加同一种抑制剂时,β-Conglycinin组的抑制效果低于酶解产物组(P0.05),同一种蛋白作为致敏原时,添加染料木素组的抑制效果明显低于添加果寡糖组。(P0.05)。下室中的β-Conglycinin及其酶解产物中仅剩下分子量为25KDa的肽段,胞质蛋白中β-Conglycinin及其酶解产物中存在这30KDa、25KDa的肽段;。即果寡糖能有效的抑制酶解后大豆抗原蛋白的吸收。综上所述:β-Conglycinin及其酶解产物处理IPEC-J2随着作用时间和刺激浓度的增加,蛋白通过网格型依赖内吞的转运方式跨上皮细胞后吸收量呈上升的趋势。在此基础上,添加适宜浓度的染料木素和果寡糖有助于抑制大豆抗原蛋白的吸收。以上研究结果为深入探讨β-Conglycinin致敏机理提供理论依据,同时也提高了大豆蛋白在动物营养行业的利用效率。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

【参考文献】