新生仔猪源大肠杆菌不同毒力因子环介导等温扩增检测方法的建立及应用

发布时间：2018-11-03 16:12

【摘要】：新生仔猪腹泻一直以来是危害养猪业的重要疾病,虽然引起仔猪腹泻的原因比较复杂,但致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原菌。目前对大肠杆菌的检测方法主要有传统的分离鉴定、免疫血清学检测以及传统的PCR方法等,但这些方法不能满足基层现场快速检测的要求。环介导等温扩增技术是Notomi等开发的一种新型的核酸扩增技术,由于该技术具有操作简单、快速便捷、特异型强、灵敏度高、成本低等特点,已经在病原微生物的检测中广泛应用。因此,该研究为满足临床的快速检测,建立了用于仔猪源致病性大肠杆菌检测及毒力分析的LAMP技术。本研究根据GenBank公布的大肠杆菌肠毒素(LT1、ST1、ST2)基因、菌毛(K88、K99、987P)基因、毒力岛(HPI、ETT2、LEE)基因序列中的保守序列,运用在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/)分别设计一套LAMP引物。并对各反应体系中的Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTP浓度、内引物浓度、BstDNA聚合酶添加量以及反应温度和反应时间进行了摸索,分别建立了检测肠毒素基因型、菌毛基因型和毒力岛基因型大肠杆菌的LAMP方法。本研究分别以肠毒素(LT1、ST1、ST2)基因型、菌毛(K88、K99、987P)基因型、毒力岛(HPI、ETT2、LEE)基因型大肠杆菌为阳性,以沙门菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌、链球菌、变形杆菌、产气荚膜梭菌、猪丹毒杆菌等8株常见细菌为阴性对照,以超纯水为空白对照,分别对建立的LAMP方法进行了特异性实验,结果显示,只有阳性菌为阳性结果,其它菌株均显阴性未发生交叉反应。此外,为验证本研究建立的LAMP方法的灵敏性,以常规PCR方法为对照,分别对本研究建立的LAMP方法的灵敏性进行了评价,结果显示,本研究建立的LAMP方法与传统的PCR方法的阳性检出率均一致,但灵敏性显著高于常规PCR方法。本研究还采用常规PCR方法和LAMP方法对采集的117份新生仔猪腹泻病料进行检测,结果表明,从42份病料(35.90%)中检测到ETEC,66份病料(56.41%)中检测到HPI+大肠杆菌,18份病料(15.38%)中检测到LEE+大肠杆菌,117份病料(100%)中均检测到ETT2+大肠杆菌,其中有19份病料(16.24%)为HPI+大肠杆菌和ETEC混合感染,18份病料(15.38%)为LEE+大肠杆菌和ETEC混合感染,42份病料(35.89%)为ETT2+大肠杆菌和ETEC混合感染,10份病料(8.55%)为HPI+、ETT2+大肠杆菌和ETEC混合感染,9份(7.69%)为LEE+、ETT2+肠杆菌和ETEC混合感染,9份(7.69%)为HPI+、LEE+、ETT2+大肠杆菌和ETEC混合感染。
[Abstract]:Diarrhea of newborn piglets has always been an important disease in pig industry. Although the causes of diarrhea in piglets are complicated, pathogenic Escherichia coli is an important pathogen causing diarrhea in piglets. At present, the detection methods of Escherichia coli mainly include traditional isolation and identification, immune serological detection and traditional PCR method, but these methods can not meet the requirements of rapid detection at the grass-roots level. Loop mediated isothermal amplification is a new nucleic acid amplification technique developed by Notomi et al. Because of its advantages of simple operation, fast and convenient operation, high sensitivity, low cost and so on. It has been widely used in the detection of pathogenic microorganisms. Therefore, in order to satisfy the rapid clinical detection, a LAMP technique was developed for the detection and virulence analysis of pathogenic Escherichia coli from piglets. This study was based on the conserved sequence of Escherichia coli enterotoxin (LT1,ST1,ST2) gene, fimbriae gene (K88N K99987P) and virulence island (HPI,ETT2,LEE) gene published by GenBank. A set of LAMP primers were designed by using online primer design software (http://primerexplorer.jp/e/). Mg2 concentration, betaine concentration, dNTP concentration, internal primer concentration, BstDNA polymerase addition amount, reaction temperature and reaction time in each reaction system were explored. The LAMP method of Escherichia coli for fimbriae and virulence island genotypes. In this study, enterotoxin (LT1,ST1,ST2) genotypes, pili genotypes (K88N K99987P), virulence island (HPI,ETT2,LEE) genotypes, Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Riemer's Duck, Pasteurella spp. Eight common bacteria such as Streptococcus sp., Proteus mutans, Clostridium perfringens, erysipelas were used as negative control, and ultrapure water as blank control. The results showed that, Only positive bacteria were positive, and no cross reaction was found in all other strains. In addition, in order to verify the sensitivity of the LAMP method established in this study, the sensitivity of the LAMP method established in this study was evaluated by comparing with the conventional PCR method. The positive rate of the LAMP method was consistent with that of the traditional PCR method, but the sensitivity was significantly higher than that of the conventional PCR method. Routine PCR and LAMP methods were also used to detect the diarrhea disease materials of 117 newborn piglets. The results showed that HPI Escherichia coli was detected from 42 samples (35.90%) of ETEC,66 samples (56.41%). LEE Escherichia coli was detected in 18 samples (15.38%) and ETT2 Escherichia coli was detected in 117 samples (100%). Among them, 19 samples (16.24%) were mixed with HPI Escherichia coli and ETEC. 18 samples (15.38%) were mixed with LEE Escherichia coli and ETEC, 42 samples (35.89%) were ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection, 10 samples (8.55%) were HPI, ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection. 9 (7.69%) were LEE, Enterobacter ETT2 and ETEC mixed infection, and 9 (7.69%) were HPI, LEE, ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection.
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

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本文编号：2308284