鸭RIG-Ⅰ基因的克隆及其抗鸭呼肠孤病毒感染的功能检测

发布时间：2018-11-06 16:48

【摘要】：2011年太湖突发以鸭软脚,排白色稀粪为主要特征的传染病,发病率达40%,病死率达10%~20%,带给养鸭业较大的经济损失。其病原为呼肠毒病毒(DRV),双链无囊膜,属于RNA病毒,至今,关于该病毒的感染与免疫机制还不清楚。RIG-I识别胞质内的RNA病毒,很快启动多种信号级联反应,激活合成一系列细胞因子,如I型干扰素,起到抗病毒感染天然免疫的作用。RIG-I可辨识包括DRV在内的双链RNA(dsRNA)病毒。但是,其在抗DRV感染过程中的作用及其机制尚不清楚。本研究在克隆鸭的RIG-I基因的基础上,采用已建立的定量RT-PCR方法,结合其它方法,检测了鸭RIG-I抗鸭呼肠孤病毒感染的功能,为深入探究鸭的抗病毒感染天然免疫及DRV的感染机理等奠定了基础。1.鸭RIG-I全基因的克隆根据已发表的鸭RIG-I基因序列,设计并合成了扩增樱桃谷肉鸭RIG-I全基因的一对引物。序列分析结果表明樱桃谷肉鸭的RIG-I全基因长2802bp,含有一个读码框(ORF),编码933个氨基酸。鸭RIG-I基因具有RLR家族的典型特征,N端由两个半胱天冬酶活化和募集结构域组成,C端由RNA解旋酶,ATP结合结构域,RNA结合结构域和抑制结构域RD组成,RIG-I蛋白第806~929位之间是高度保守的结构功能域。序列比对分析结果显示,樱桃谷肉鸭RIG-I的序列与已报道的番鸭RIG-I序列同源性最高,为98.4%~99.8%,与鹅的同源性较高,为95.9%;但与人、鼠、草鱼的同源性较低,分别为62.3%、61.5%、61.2%;与猪的同源性最低,仅为54.4%,表明RIG-I基因在不同种属之间存在很大差异性。2.DRV荧光定量PCR检测方法的建立将标准品质粒pET-30a-DRVδC(本实验室保存)定量后,10倍稀释,做8个稀释度,每个稀释度3个重复,系统自动生成标准曲线。本研究成功建立DRV标准曲线,相关系数R2=0.998,系统生成的回归方程为:Y=-3.458x+42.19,最低可检测底物浓度为100copies/?L。3.鸭RIG-I荧光定量PCR检测方法的建立我们扩增鸭RIG-I基因,将其克隆到PEASY-T5载体上,测序正确后,将其定量后作为重组标准品质粒10倍稀释,做8个稀释度,每个稀释度3个重复,进行实时荧光定量PCR扩增反应,系统自动生成标准曲线,本研究成功建立鸭RIG-I标准曲线,相关系数R2=0.998,系统生成的回归方程为:Y=-3.327 x+33.01,溶解曲线峰单一,最低可检测底物浓度为10copies/?L。4.鸭RIG-I转染细胞对DRV复制的影响为了验证鸭RIG-I是否具有抗病毒功能,我们将duRIG-I转染DEF和DF1细胞,感染DRV后发现其均能增强I型干扰素和Mx活性,病毒滴度降低。本研究表明外源表达鸭RIG-I可发挥抗DRV效应。5.内源性鸭RIG-I在抗DRV病毒感染中的作用为了验证duRIG-I是否引起DRV先天性免疫,我们首先检测了鸭RIG-I组织分布,然后用DRV分别感染DEF和鸭,发现DEF感染DRV后duRIG-I mRNA,IFN-αm RNA,Mx mRNA水平均上调,感染DRV后鸭的脾和肾中duRIG-I mRNA,IFN-αmRNA,MxmRNA水平均出现上调,体内体外试验中病毒增殖均受到抑制。本试验获得鸭的RIG-I基因,进行了一系列的细胞和动物实验,证明鸭RIG-I在抗DRV先天性免疫中发挥重要作用。
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【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.32

【引证文献】