猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白诱导猪肺泡巨噬细胞白介素-10表达的分子机制研究

发布时间：2018-11-18 12:08

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。该病是危害全球养猪业发展的主要疫病之一,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV感染的典型特征是能够引发猪体免疫抑制,使得先天免疫应答不足,获得性免疫发展微弱,中和抗体应答迟缓,从而容易发生其它病毒或细菌的混合感染或继发感染。细胞因子(cytokine, CK)是一类能在细胞间或细胞内部传递信息的蛋白质或小分子肽,许多细胞因子在先天免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制性调节作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括PRRSV.我们研究发现,PRRSV (ZCYZ株)核衣壳蛋白能够显著上调可传代猪肺泡巨噬细胞的IL-10 mRNA水平。围绕其具体分子机制的解析工作,本论文开展了以下研究：1. PRRSV (ZCYZ株)核衣壳蛋白真核表达载体的构建及活性鉴定针对PRRSV ZCYZ株核衣壳蛋白基因序列设计特异性的表达引物,并在上游引物添加Flag标签序列；目的基因和载体经双酶切后连接构建pCI-neo-N载体；重组载体经PCR、双酶切、测序验证连接成功后,运用间接免疫荧光(IFA)和Western-blot检测目的蛋白的生物学特性。结果表明,成功构建能够表达PRRSV (ZCYZ株)核衣壳蛋白的真核表达载体。2.猪IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立本试验针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法。该方法线性关系良好；敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰；重复性良好,组内变异系数小于2%,组间变异系数小于3%；目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10 mRNA水平的表达分析。3. PRRSV (ZCYZ株)核衣壳蛋白诱导猪肺泡巨噬细胞IL-10表达的分子机制研究我们发现PRRSV (ZCYZ株)核衣壳蛋白能够诱导猪肺泡巨噬细胞IL-10表达,但具体分子机制还尚不清楚。本试验探索了核衣壳蛋白(N蛋白)转染时间与转染剂量诱导IL-10表达的动力学规律。通过研究MAPK、PI3K以及NF-κB等相关信号通路初步阐释了N蛋白诱导猪PAM细胞IL-10 mRNA升高的分子机制。利用蛋白解析技术试图探索N蛋白中诱导IL-10表达的关键氨基酸区段以及位点,但所有构建的N蛋白缺失突变体均显著丧失了上调IL-10表达的能力,揭示N蛋白的完整性对于诱导IL-10表达至关重要；最后我们选取仍保留有部分IL-10诱导能力的缺失突变蛋白进行IL-10分泌信号通路的研究,进一步验证了完整N蛋白上调IL-10的分子机制。本研究对阐明PRRSV免疫抑制机制及新型疫苗的设计具有重要意义。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), commonly known as the 鈥渂lue ear disease鈥，

本文编号：2340005