影响山羊精原干细胞分离纯化和体外培养的因素研究

发布时间：2018-11-18 20:37

【摘要】：精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物生殖细胞中唯一的干细胞,在体外长期培养一直是国际性的难题和研究的热点。目前已经建立了小鼠、大鼠和仓鼠三个物种的精原干细胞体外长期培养体系,但在其它物种、特别是家畜尚未获得理想的培养体系。本课题通过检测分离山羊SSCs的纯度来确定最适的实验动物年龄;利用丝裂霉素-C和胰蛋白酶先后共同处理三种细胞(MEF、STO、Hela)后,检测细胞增殖能力的稳定性来筛选出最佳的饲养层制备条件;分别采用不同浓度的血清及三种外源添加物(即枸杞多糖、维生素C、细胞分裂素)体外培养SSCs,检测SSCs克隆数量及其增殖能力,最终确定山羊SSCs体外培养的最佳方案。具体研究内容和结果如下:1.山羊年龄对SSCs分离纯化效果的影响分别取2-5月龄的波尔山羊睾丸,以CDH1、UCHL1和THY1作为鉴定山羊SSCs的表面表型标记,通过检测不同月龄山羊睾丸中不同分子标记的定位、m RNA和蛋白表达量,结果显示在2、5月龄睾丸中均有CDH1和UCHL1的定位表达;CDH1m RNA和蛋白表达量随着月龄增加而下降,其中2月龄表达量最高;而THY1和UCHL1的表达量先上升后下降,在3月龄达到最高值。此结果表明2-3月龄是分离纯化山羊SSCs的最优年龄。2.丝裂霉素-C处理时间和胰蛋白酶对饲养层制备效果的影响取小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、鼠胚成纤维细胞系(STO)和子宫颈癌细胞(Hela)三种细胞作为饲养层。其中MEF分成6大组,分别用10μg/m L丝裂霉素-C处理不同时间(0h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h)后,各组再分成2小组,其中一组用0.25%胰蛋白酶消化作为处理组,另一组不做处理作为非处理组,并在不同培养时间下检测增殖能力,以增殖能力稳定性和组间差异显著性作为评定依据。STO和Hela处理方法同MEF。结果显示,非处理组增殖能力稳定,而处理组增殖能力不稳定,这表明处理组不利于制备饲养层细胞;在非处理组中,丝裂霉素-C处理MEF细胞1.5h、STO细胞2.5h、Hela细胞2.5h时,细胞增殖能力比较稳定,并与对照组差异显著(P0.05)。此结果表明不经过胰蛋白酶消化处理的方法最好,并且10μg/m L丝裂霉素-C处理MEF细胞1.5h,STO细胞2.5h,Hela细胞2.5h是最优选择。3.血清浓度对山羊SSCs体外培养效果的影响在添加不同浓度血清(0%、1%、2.5%、5%)的培养体系中培养山羊SSCs,以SSCs克隆数及其增殖能力作为评定依据。结果显示,在培养第3d时,5%血清组克隆数显著高于其它组(P0.05),但克隆数随着时间的增加而大幅度减少,增殖能力明显下降;在第6d和第10d时,2.5%血清组显著促进SSCs的增殖,并且克隆数显著高于其它组(P0.05),增殖速度最快。此结果表明5%血清浓度不利于SSCs体外长期培养,而2.5%血清浓度是体外培养体系的最优选择。4.枸杞多糖浓度对山羊SSCs体外培养效果的影响在添加不同浓度枸杞多糖(LBP)(0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、300μg/m L)的培养体系中培养山羊SSCs,以SSCs克隆数及其增殖能力作为评定依据。结果显示,200μg/m L和300μg/m L LBP组克隆数一直显著低于对照组(P0.05),并且100μg/m L、200μg/m L和300μg/m L LBP组克隆数随着培养时间的增加而减少;在培养第6d和第10d时,50μg/m L LBP组SSCs克隆数最多,增殖速度最快。此结果表明高浓度LBP抑制SSCs增殖,添加50μg/m L LBP是SSCs体外培养的最优选择。5.维生素C浓度对山羊SSCs体外培养效果的影响在添加不同浓度维生素C(VC)(0μg/m L、10μg/m L、20μg/m L、30μg/m L、40μg/m L)的培养体系中培养山羊SSCs,以SSCs克隆数及其增殖能力作为评定依据。结果显示,随着时间的增加,各组克隆数均是先上升后下降;在第6d和第10d时,克隆数随着浓度的升高而增加,且各组之间差异显著(P0.05),但40μg/m L VC组在第7-10d的增殖能力显著低于其它组(P0.05);在培养第8-10d时,30μg/m L VC组增殖能力基本保持不变,但其它组均下降,并且30μg/m L VC组克隆数显著高于其它低浓度组(P0.05)。此结果表明40μg/m L VC不利于SSCs体外长期培养,添加30μg/m L VC是SSCs体外培养的最优选择。6.细胞分裂素浓度对山羊SSCs体外培养效果的影响在添加不同浓度细胞分裂素(6-BA)(0ng/m L、25ng/m L、50ng/m L、75ng/m L、100ng/m L、125ng/m L)的培养体系中培养山羊SSCs,以SSCs克隆数及其增殖能力作为评定依据。结果显示,在培养第6d和第10d时,100ng/m L 6-BA组克隆数显著高于其它组(P0.05),但所有试验组增殖能力均低于对照组,这表明6-BA不适于SSCs长期体外培养。此结果表明添加100ng/m L 6-BA是SSCs短期体外培养的最优选择。综上所述,本试验中体外培养山羊SSCs的最佳条件是,选取2-3月龄的山羊分离睾丸精原干细胞,同时利用无胰蛋白酶消化处理的MEF饲养层细胞和2.5%浓度的血清可以显著提高SSCs的增殖能力。此外,分别添加50μg/m L LBP或30μg/m L VC或100ng/m L 6-BA均能有效地促进体外培养山羊SSCs的增殖,并且添加30μg/m L VC培养的促进效果最为显著。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827

【参考文献】

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1 刘慧莲;;枸杞多糖对小鼠精原干细胞增殖作用的影响[J];安徽农业科学;2012年03期

2 张学明;李德雪;于家傲;岳占碰;;精原干细胞的生物学特性[J];细胞生物学杂志;2006年01期

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1 胡甜园;绵羊精原干细胞标记分子CDH1多克隆抗体的制备及应用[D];内蒙古大学;2011年

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本文编号：2341154