IBDV毒力分子机制研究及反向遗传操作系统的建立

发布时间：2018-11-28 14:29

【摘要】：传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBDV有两个血清型,血清Ⅰ型和血清Ⅱ型,其中Ⅰ型对鸡有致病性,Ⅱ型可以感染鸡和火鸡,但均没有致病性。根据抗原和毒力的差异,血清Ⅰ型毒株可以分为经典毒株(classical strains)、变异株(variant strains)和超强毒株(very virulent strains,vv IBDV).我国从上个世纪90年代开始出现vv IBDV,目前分离的野毒株也主要是vv IBDV。本研究通过对国内近年来分离的5株vv IBDV的VP2基因进行测序,发现其在七肽区326-332的氨基酸均为SWSASGS,在与毒力相关的特征性氨基酸位点:222A、253Q、256I、279D、284A、294I和299S也都没有发生变化。通过SPF鸡致病性试验,5个毒株引起的死亡率都在47%以上,说明vv IBDV近20年来毒力比较稳定,没有发生明显变化;5个毒株中,GX与QL,HB96与HBY核苷酸同源性较高,分别达到99.8%和99.5%,说明不同年代的分离株变异不大,同源性很高。B87是当前使用最为广泛的疫苗株,为了比较vv IBDV与B87序列之间的差异,对B87株种毒的不同鸡胚传代毒的VP2片段进行测序和分析,发现E2和E6代毒株VP2序列存在7个氨基酸的变化。将E2和E6接种CEF细胞,发现E2不能在CEF上增殖,而E6可以产生明显的CPE,说明两个毒株对CEF的嗜性不同。分别将E2和E6接种3周龄SPF鸡,进行毒力比较,第7天开始,E2代出现囊体比下降,BB指数明显低于E6代毒株;E2代法氏囊滤泡萎缩严重,结构松散,E6代毒株只有部分滤泡出现萎缩,滤泡间隔基本正常,说明E2,E6代毒株对SPF鸡的法氏囊毒力存在明显差异。根据IBDV相关研究结果以及两个毒株的VP2序列差异,推测Q253H/D279N/A284T三个位点是影响IBDV毒力和细胞嗜性的分子基础。为进一步研究影响IBDV毒力和细胞嗜性分子机制,利用高保真的DNA聚合酶通过一步法扩增获得IBDV B87基因组A,B片段,并通过重叠PCR的方法成功在基因组两端引入Ham Rz和Hdv Rz核酶序列,保证转录水平基因组的完整性,然后将带有核酶序列的A,B片段克隆到真核表达载体p CAGGS的CMV增强子和鸡β-actin启动子下游,成功构建出含有B87完整基因组的p CAGGSA和p CAGGSB真核表达载体,经脂质体介导共转染DF1细胞,12h后可以通过间接免疫荧光检测到IBDV特异的蛋白。
[Abstract]:Infectious bursal disease (Infectious bursal disease,IBD) is an acute and highly contagious disease in chickens caused by infectious bursal disease virus (Infectious bursal disease virus,IBDV). IBDV has two serotypes, serotype I and serotype 鈪，

本文编号：2363128