表达鸡球虫EtMIC3和EtAMAI沙门氏菌活载体疫苗的构建及免疫效果的研究

发布时间：2018-12-07 10:38

【摘要】：鸡球虫病是由鸡球虫寄生于鸡的小肠及盲肠上皮细胞内引起的寄生性原虫病,对养禽业造成了巨大的经济损失。目前,防控鸡球虫病的主要措施包括药物预防以及活疫苗的使用,其中,活疫苗包括强毒疫苗和弱毒疫苗。但是,药物的大量使用容易导致环境污染和药物残留,对环境和人的健康造成危害。强毒苗使用不当能够在鸡群中引起鸡球虫病的爆发,而弱毒苗的生产成本较高。这使得对鸡球虫病的防控不能达到理想的效果。研发高效廉价的新型疫苗已成为防控球虫病的重要措施之一。活载体疫苗兼有弱毒疫苗的免疫效力高、灭活疫苗的安全性好等优点,并且使用时不需要添加佐剂,可同时构建多价苗,成本低,为鸡球虫病的防控提供了新的选择。选择免疫原性较好的抗原是构建活载体疫苗的关键。通过对鸡球虫生活史的研究发现,微线在虫体粘附和侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。微线是顶体复合器的重要组成部分,位于子孢子和裂殖子前端,在虫体入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用。多种微线蛋白已被证明具有良好的免疫原性。柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3(EtMIC3)和顶膜抗原1(EtAMA1)是两种重要的微线蛋白。对EtMIC3和EtAMA1蛋白氨基酸序列进行分析后,本研究选择抗原性较好的EtMIC3蛋白的部分片段及EtAMA1蛋白的胞外区作为候选疫苗抗原。根据GenBank中公布的核苷酸序列,设计EtMIC3和Et AMA1序列的特异性引物,对基因克隆后进行序列测序,并与已公布的序列进行比对分析,结果表明,这两个基因分别发生了2个和5个突变。将EtAMA1片段克隆至原核表达载体,转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达重组蛋白。用蛋白免疫小鼠制备EtAMA1多克隆抗体。分别将EtMIC3和EtAMA1基因片段克隆至沙门氏菌表达载体pYA3342,鉴定筛选阳性重组质粒pYA3342-EtMIC3和pYA3342-EtAMA1,并将阳性重组质粒电转化至减毒沙门氏菌疫苗菌株X4550内。对阳性重组菌在体外的表达进行了鉴定,western blot结果显示,重组沙门氏菌X4550(pYA3342-EtMIC3)和X4550(pYA3342-EtAMA1)能够在体外分别表达EtMIC3和EtAMA1。预实验中,对重组疫苗菌株的安全性以及在体内的存活时间进行了检测,结果显示,该重组疫苗菌株不会引起免疫鸡的临床症状,在体内的存活时间大约为20天。利用鸡球虫感染试验对这两个重组疫苗株的免疫保护效果进行了探究。120只四日龄雏鸡随机平均分成6组,I、II组为PBS对照组,III、IV、V组分别口服免疫空载体疫苗、表达EtMIC3抗原疫苗和表达EtAMA1抗原疫苗。VI组混合免疫表达EtMIC3抗原的疫苗和表达EtAMA1抗原的疫苗,免疫剂量为109CFU。25日龄时,对II、III、IV、V、VI组口服接种12000个E.tenella孢子化卵囊。35日龄时,对结果进行分析。通过对比各组之间的体重增长、相对增重率、卵囊排出量、卵囊减少率、盲肠病变计分对疫苗的免疫保护效果进行了评价。结果显示,与对照组相比,免疫表达EtMIC3抗原的疫苗组、免疫表达EtAMA1抗原的疫苗组和混合免疫组在攻虫第七天时,相对增重率分别为80.49%、75.21%和87.82%;卵囊减少率分别为61.9%、46.03%和63.49%;盲肠病变记分分别为2.0、2.3和1.7。动物试验结果表明,携带球虫抗原的减毒沙门氏菌活载体疫苗株能够对球虫的感染提供一定的保护作用。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31

【参考文献】