猪IFI30在体外细胞中抑制PRRSV增殖及对细胞凋亡的影响

发布时间：2018-12-10 12:03

【摘要】：抗病育种能够提高猪的抗病力,对养猪业的健康发展有着非常重要的作用。研究发现猪对猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的抗病力在不同猪种及不同个体间差异显著。猪干扰素γ诱导蛋白30(IFI30),能够在专职抗原递呈细胞中组成性表达,在其他细胞中可被IFN-γ等一些炎症因子诱导表达或表达量上调。其主要功能是催化蛋白质二硫键的还原。其在Ⅱ类MHC限制性抗原加工递呈过程中起关键性作用。有研究表明IFI30的表达情况对机体抗病毒免疫、肿瘤免疫以及应答状态有影响。前期实验研究发现当猪感染不同剂量的PRRSV时,猪肺巨噬细胞(PAMs)中IFI30的表达量发生变化,本研究的主要目的是探讨猪IFI30对PRRSV在体外细胞中的增殖以及对感染宿主细胞的影响。本研究首先从采取的猪肺脏组织中扩增出IFI30中长度741bp的CDS区,将其克隆到带有红色荧光的真核表达p EF1a-IRES-Ds Red-Express2上,构建出p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表达载体并将其转染到对PRRSV敏感的Marc145细胞和猪睾丸细胞(ST细胞)中,通过荧光显微镜观察转染率以及q RT-PCR和Western Blot验证构建的表达载体,实验结果显示:在Marc145细胞和ST细胞中IFI30载体的转染率达到80%以上,转染表达载体后的IFI30的m RNA水平和蛋白表达量都显著高于对照组(P0.01)。其次,将p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表达载体以及空载体转染进Marc145细胞中,24小时后转染率达到80%~90%,然后接种1MOI的PRRSV,24小时后搜集细胞上清液,提取病毒RNA,进行绝对荧光定量PCR检测病毒RNA水平的变化,并且提取病毒总蛋白,Western Blot检测病毒M蛋白的表达水平。用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染方法检测Marc145细胞的凋亡率。实验结果发现:猪IFI30在Marc145细胞中表达时,PRRSV在宿主细胞中的拷贝数显著低于空载组和对照组(p0.01),PRRSV的M蛋白的表达水平也显著低于空载组和对照组(p0.01)。流式细胞术检测猪IFI30表达组的细胞凋亡率(20.60%)显著低于转染空载组(66.0%)和对照组(64.66%)的凋亡率(p0.01)。最后,我们将猪IFI30的表达载体、表达空载体、干扰载体、干扰空载体四种质粒分别转染到猪睾丸ST细胞中,没有处理过的细胞作为阴性对照组。转染24小时后,接种1MOI PRRSV,24小时后各组分别搜集细胞上清液,提取病毒RNA,进行绝对荧光定量PCR检测病毒RNA水平的变化,并且提取病毒总蛋白,Western Blot检测病毒M蛋白的表达水平。流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染方法检测ST细胞的细胞凋亡水平。实验结果发现:与阴性对照组相比,IFI30基因的表达空载组和干扰空载组的PRRSV病毒的拷贝数和PRRSV的M蛋白表达水平没有发生显著变化,ST细胞的凋亡水平也没有显著变化。而转染p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表达载体,使得ST细胞中IFI30基因表达明显升高时,PRRSV的病毒拷贝数和M蛋白量降低,证明PRRSV的复制受到IFI30的抑制。流式细胞术检测发现IFI30过表达的ST细胞的凋亡率(9.73%)低于表达空载组(10.38%)。当抑制IFI30基因的表达时,PRRSV的病毒拷贝数明显上升,ST细胞的凋亡率(25.48%)也显著高于干扰空载组(11.46%)。结论:猪IFI30在体外培养的Marc145细胞和ST细胞中抑制接种的PRRSV增殖,并降低了因接种PRRSV而引起的细胞凋亡。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28

【参考文献】