文昌鸡性成熟启动前后下丘脑部分功能基因和miRNA表达谱的变化

发布时间：2018-12-11 20:09

【摘要】：性早熟在人类上表现为病理状态,而在家禽生产上则是一个具有重要经济价值的性状。我国地方鸡品种资源的早熟特性十分明显,开展鸡性成熟调控机制研究,对于高产蛋鸡和优质肉鸡育种具有重要意义。同时,鸡作为重要的模式生物,其早熟性相关研究也可为人类性早熟疾病临床诊断、治疗提供科学依据。性成熟启动是一个复杂的生物学过程,决定性成熟启动的关键性事件是下丘脑GnRH脉冲式释放增加。近年来研究发现,诸多功能基因和调节因子参与了性成熟启动,性成熟启动基因的转录抑制可能起到了重要作用,防止了性成熟的过早发生;模式生物和哺乳动物(包括人类)发育时机研究提示miRNA和性成熟启动之间有潜在联系;进入血液循环的外泌体所装载的miRNA能在血清(浆)中稳定存在,并且其拷贝数变化能反映机体生理和病理状态改变,是一种新型生物标志物。本论文选取早熟地方鸡品种文昌鸡为实验素材,主要开展了以下几个方面的研究:(1)测定不同发育时期文昌鸡母鸡鸡冠、性腺组织的发育性变化和血清LH浓度变化,度量文昌鸡母鸡的性成熟启动时机,为构建性成熟启动前、后高通量测序文库提供基础。(2)利用qRT-PCR技术检测了c-Myc/LIN28/let-7通路、POK/PcG/TRG通路部分功能基因在性成熟启动前、后文昌鸡下丘脑中的表达变化规律。(3)利用Solexa高通量测序技术检测了鸡性成熟启动前、后下丘脑中miRNA表达谱,结合生物信息学分析,探讨miRNA在鸡性成熟启动调控中的作用。(4)利用Solexa高通量测序技术检测了鸡性成熟启动前、后血清(浆)中miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA,并利用qRT-PCR技术检测候选miRNA在性成熟启动及进程中的表达规律,建立鸡性成熟启动度量特异性循环miRNA标记检测技术。综合本论文的研究结果,主要得出以下结论:(1)性成熟启动时机度量在发育早期,文昌鸡鸡性腺组织发育缓慢,卵泡保持原始状态,这一过程约持续12周。12周龄后,性腺组织进入快速发育期,13周龄母鸡的卵巢重量(1.35g)和输卵管长度(15.68cm)与12周龄测量值(0.60g、7.16cm)相比,分别增加了125%和120%,同时出现等级前小白卵泡(SWF,直径1.0～2.0mm)或大白卵泡(LWF,直径3.0～5.0mm)。LH水平的增加与性腺组织的快速发育相一致,LH水平在13周龄显著增加(P0.01),并在14～15周龄达到峰值,至开产后下降至较低水平。确定了13周龄为文昌鸡母鸡的性成熟启动关键转折点,这为构建性成熟启动前、后高通量测序文库提供了前提。(2)性成熟启动调节通路功能基因表达规律qRT-PCR检测发现c-Myc、LIN28B基因在文昌鸡性成熟启动关键时机(12周龄至13周龄)下丘脑组织中的表达水平显著降低(P0.05,P0.01),且c-Myc基因的低表达能够持续到开产,而LIN28B基因表达水平在开产前(15周龄)又恢复至较高水平;与之相对应的是,Solexa高通量检测发现性成熟启动后let-7a、let-7b和let-7g表达水平升高。BCL6、ZBTB7A基因在性成熟启动前期下丘脑中的表达水平较低,性成熟启动后BCL6基因表达水平显著升高(P0.01),ZBTB7A基因表达水平虽有所升高,但与前期相比差异并不显著(P0.05),其表达水平的显著性变化(P0.01)发生在15周龄,且在开产后仍维持较高水平。YY1、EED基因在性成熟启动前期下丘脑中的表达水平较高,性成熟启动后表达水平显著降低(P0.01),且这种低水平表达仅维持2～3周,15周龄后又恢复至较高水平,并持续至开产。Oct-1基因在文昌鸡性成熟启动前期下丘脑中的表达水平较低,性成熟启动后表达水平显著升高(P0.01),且至开产仍保持较高水平,而TT1基因表达水平在性成熟启动后显著降低(P0.01)。总体上,研究结果支持基于哺乳动物数据构建的多层次等级基因调节通路模式,即c-Myc(↓)→LIN28(↓)-|let-7(↑),POK(↑)-|PcG(↓)-|TRG(↑)(→表示促进作用,-|表示抑制作用),进一步证实了该调控通路与性成熟启动调节相关。推测通路调节功能在脊椎动物、哺乳动物(包括人类)进化上是保守的,多层次等级基因转录抑制作用可能防止了性成熟的过早发生。(3)性成熟启动前后下丘脑miRNA表达谱通过高通量测序,在鸡下丘脑中鉴定出374个已知miRNA、46个新miRNA,144个已知miRNA(reads10)的表达水平在性成熟启动前后发生了显著改变(P0.05)。5个差异表达miRNA被qRT-PCR方法进一步验证。15个差异最显著miRNA(| log2(fold-change)|2.0,P0.01)预测到2013个靶基因,其中7个时钟基因Per2、Bmal1/2、Clock、Cry1/2和Star被差异miRNA靶向多次,qRT-PCR检测表明这些时钟基因的基础转录水平在性成熟启动后下丘脑中显著升高(P0.01)。GO富集和KEGG调节通路分析结果表明,这些差异表达miRNA在性成熟启动转录调节和信号转导通路中发挥了重要作用。表明miRNA是参与鸡性成熟启动新的调节因子。鉴于miRNA功能的保守性,该研究结果将为深入开展动物(包括人类)性成熟的分子调控机制研究提供新的理论依据。(4)性成熟启动前后循环miRNA表达谱和循环miRNA标记通过高通量测序,在血清、血浆中鉴定出共表达miRNA 192个,血清中特异性表达miRNA 1个,血清中特异性表达miRNA4个,新发现miRNA 19个(reads10)。针对同一miRNA,在相同发育时期血清、血浆中的表达丰度基本一致。性成熟启动前、后血清中差异表达miRNA(P0.05)有130个,其中表达上调的有68个,下调的有62个。40个差异表达miRNA(| log2(fold-change)丨1.0,P0.01)预测到4829个差异表达基因。GO富集和KEGG调节通路分析结果表明,这些差异表达miRNA主要参与蛋白水解、卵母细胞分裂、MAPK信号传导及基础转录等通路。qRT-PCR检测结果表明,let-7a、miR-29c-3p、miR-217-5p、miR-375、miR-215-5p、miR-155、miR-9-5p、miR-19b-3p和miR-133a-3p等9个候选miRNA在性成熟启动时机(12至13周龄转变)表达变化趋势与Solexa测序结果基本一致。候选miRNA在性成熟启动前期血清中表达水平基本一致,就性成熟启动时机(12至13周龄转变)而言,miR-29c-3p(p=0.000)、miR-375(p=0.002)、miR-215-5p(p=0.013)、miR-9-5p(p=0.034)、miR-19b-3p(p=0.008)、miR-133a-3p(p=0.006)和let-7a(p=0.002)的表达水平显著升高,miR-217-5p(p=0.112)和miR-155(p=0.174)的表达水平并未发生显著性变化,基于这7个候选miRNAs组成的特异性新型标记可用于文昌鸡性成熟启动时机的精确度量。鉴于miRNA功能的保守性,这些循环miRNA标记可以为其它动物性成熟启动度量及人类性早熟诊断提供借鉴。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S831
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本文编号：2373149