EHEC O157:H7部分蛋白的原核表达纯化及免疫学特性研究

发布时间：2018-12-11 21:33

【摘要】：目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)是全球食源性疾病的主要病原之一,自从1982年被报道作为一种肠道致病菌以来,已经在我国以及世界范围内引起多次暴发流行,散发病例更是经常见诸各种临床杂志和报道。EHEC O157:H7感染对人类健康和食品行业都带来了明显的经济损失。由于尚未有预防或者特殊的治疗方式,了解EHEC O157:H7如何感染宿主及其致病方式对于避免EHEC O157:H7的暴发和改进治疗方式将有重要意义,对有针对性地开发治疗创新药物、设计治疗方案、研制有效疫苗、制定预防控制措施具有重要的理论指导作用。大肠杆菌引起感染主要取决于其毒力因子,目前研究报道较多的有紧密黏附素(Intimin)及紧密黏附素受体(Tir)和III型分泌系统效应蛋白。EHEC O157:H7通过III型分泌系统将其毒力蛋白转运至宿主细胞内,与宿主细胞发生作用,介导宿主肌动蛋白聚集,引起粘附与擦拭(A/E)损伤。但是此过程中具体的信号转导通路至今尚不清楚。了解引起粘膜擦拭损伤相关的蛋白,对阐明EHEC O157:H7的致病机制有重要的意义。本研究的目的是对预测的EHEC O157:H7 III型分泌系统的分泌蛋白进行逐级筛选鉴定,对筛选出的Z2322、Z2340等7个蛋白基因进行克隆表达及纯化,并进行动物实验,分析成功表达纯化的Z2322、Z2340等5个蛋白在小鼠体内产生的体液免疫和细胞免疫应答,进一步明确其刺激小鼠产生的免疫应答类型(Th1/Th2),为研究Z2322、Z2340等5个蛋白在EHEC O157:H7的致病机制中的作用以及为新型疫苗的研制奠定基础。方法:以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因组为基础,用LipoP等七个在线预测软件预测Z2322、Z2340等7个蛋白是否含有信号肽、是否可能为内膜蛋白或者外膜蛋白、预测其亚细胞定位并分析其核苷酸序列的保守性。以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因组为模板对Z2322、Z2340等7个蛋白的基因片段进行PCR扩增,同时引入酶切位点BamHI和Xho I,目的基因双酶切后的回收产物分别与pET-22b(+)等四个表达载体相连,转化到E.Coli BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下表达融合蛋白,并对融合蛋白的表达形式进行鉴定。将成功表达的蛋白用Ni亲和柱进行纯化并制备鼠抗蛋白血清,采用ELISA方法检测蛋白的免疫原性。将免疫的小鼠分别在21、28、35、42天尾静脉采血收集血清,ELISA检测IgG抗体及其亚型(IgG1、IgG2a、IgG3)的效价,分析其刺激小鼠产生的免疫应答类型(Th1/Th2)。将免疫后的小鼠用EHEC O157:H7 EDL933株进行攻毒,检测蛋白对小鼠的保护性。在攻毒后每日采集小鼠粪便检测其活菌排菌量,确定蛋白对细菌定植的影响。结果:1.通过LipoP、Lipo、SignalP 4.1软件预测,Z2322、Z2340、Z2354、Z2691、Z3074、Z3322和Z3955蛋白不存在信号肽。经预测软件TmHmm和Bomp分析,这些蛋白不存在α-螺旋和β-桶状结构。亚细胞定位软件PSORTb 3.0.2和CELLO v.2.5分析发现,这些蛋白可能分泌至细胞外,且通过BLAST比对发现这些蛋白核苷酸序列保守性较高。2.成功克隆Z2322、Z2340等七个预测蛋白基因片段并构建出重组质粒,经IPTG诱导,成功表达出E.coli BL21-pET-28a-Z2691、E.coli BL21-pET-30a-Z2322等10个重组蛋白。其中E.coli BL21-pET-28a-Z2691等5个蛋白在上清中表达,为可溶性蛋白;E.coli BL21-pET-30a-Z2322等5个蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。3.用不同的方法分别纯化可溶性蛋白和包涵体蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白分子量大小与预期一致。ELISA方法检测Z2322、Z2340、Z2691、Z3322和Z3955抗血清的效价,Z2340、Z2691和Z3955为62500EU,Z2322为12500EU,Z3322为2500EU。Z2322、Z2340、Z2691、Z3322能刺激小鼠机体产生的以Th2型免疫占优势的免疫应答,Z3955能刺激机体产生以Th1型免疫占优势的免疫应答。4.免疫保护性实验显示,Z2340、Z2691和Z3955、Z2322能降低小鼠死亡率对其产生较好的保护作用,Z3322能延长小鼠的存活时间,对其产生一定的保护作用。这与ELISA方法检测各蛋白刺激小鼠产生的抗血清效价结果一致。活菌排菌量实验结果显示,Z2322、Z2340、Z2691、Z3955蛋白免疫组分别在攻毒后第6d、7d、9d、9d后检测不到O157:H7活菌,Z3322蛋白免疫组活菌排菌量少于对照组,说明Z2322、Z2340、Z2691、Z3955能缩短EHEC O157:H7在小鼠体内的存活时间,减少食物链的污染,Z3322缩短EHEC O157:H7在小鼠体内的存活时间的作用则不明显。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

【参考文献】