【摘要】：猪链球菌作为重要的人畜共患病原菌,自报道以来已引起世界范围的广泛流行。最初大环内酯类药物能够有效治疗猪链球菌病,但目前猪链球菌对大环内酯类的耐药问题已较为严重。耐药机制对宿主菌适应性的影响决定着细菌耐药性的传播速度,为有效控制大环内酯类耐药猪链球菌的产生和流行,我们有必要对其耐药性及适应性进行研究。本文分别研究了耐药基因及靶位突变对大环内酯类耐药株适应性的影响,旨在为有效控制耐药菌的扩散和流行提供理论依据。一、耐药基因mefA/msrD对宿主菌的体外适应性影响首先对携带mefA/msrD基因的耐药菌株及相关参照敏感菌株进行生长曲线测定,并比较生长动力学参数,通过体外竞争试验比较耐药菌株与敏感菌株的相对适应性;而后通过构建mefA相关载体并转入大肠杆菌DH5α,探究mefA对宿主菌耐药性及适应性的影响;最后利用pSET4s构建温敏性自杀重组质粒,对耐药猪链球菌NJ-2中的msrD基因进行定点无痕缺失,以期构建msrD基因缺失突变株来研究msrD对宿主菌适应性的影响。结果显示体外竞争试验测得携带外排泵的各耐药菌株与亲本株体外适应性无显著差异;mefA基因成功转化入DH5α后,其对大环内酯类药物的敏感性会下降,但未发现可检测到的适应性代价;通过融合PCR方法将msrD基因的上下游同源臂连接在一起后,成功构建得到同源重组质粒pSET4s::msrDL-mrDR。将该同源重组质粒电转入受试菌株后,未能够成功筛选到发生同源重组的阳性缺失菌株,推测可能是msrD基因对受试菌株的适应性起到关键作用。二、甲基化酶基因ermB对宿主菌的体外适应性影响首先对临床分离的猪链球菌大环内醋类耐药株的适应性进行评价。PCR检测受试菌株中的甲基化酶基因ermB,对携带ermB基因的耐药菌株及参照敏感菌株进行了生长曲线的测定,并将计算得到的各耐药菌株与敏感菌株的生长动力学参数进行比较;最后通过体外竞争试验比较耐药菌株与敏感菌株的相对适应性,而后构建ermB耐药基因相关载体并转化入大肠杆菌,初步探究ermB对宿主菌耐药性及适应性的影响。结果显示:耐药菌株HB1004、HB1010及SC05017相对两株敏感菌株BA853和SS2-1的体外适应性差异均不显著,但JS07002与两株参照敏感菌株相比均表现为体外适应性较低。ermB基因在大肠杆菌中会显著提高其对大环内酯类药物的耐药性,同时该基因会显著降低宿主大肠杆菌的体外适应性。三、药物作用靶位突变对耐药猪链球菌适应性的影响挑选四株不同来源的大环内酯类敏感猪链球菌作为研究对象,用红霉素、阿奇霉素及泰乐菌素分别对受试敏感菌株进行体外诱导耐药;对获得的高水平耐药菌株的耐药表型和基因突变型进行检测;然后分析高水平耐药菌的体外及体内适应性。结果发现:诱导所得的所有高水平耐药菌的23S rRNA都存在位点突变,部分菌株存在L4及L22的位点突变;对所有的亲本株和耐药菌株进行体内及体外适应性分析发现,发生突变的高水平耐药菌的适应性与其亲本株相比大多数出现适应性下降仅A2059位点突变无适应性代价,甚至会提高突变菌株适应性。综上所述,携带mefA-msrD的猪链球菌与参照敏感菌株的体外竞争力无显著差异,mefA可介导DH5α对14-,15-元大环内酯类抗生素低度耐药,且无适应性代价;携带ermB的猪链球菌JS07002与参照敏感菌株相比体外竞争力较低,ermB基因在显著提高DH5α对大环内酯类药物耐药性的同时会降低其体外适应性。体外诱导得到的高水平大环内酯类耐药猪链球菌存在23S rRNA及核糖体蛋白L4、L22的结构关键位点的突变。在23S rRNA基因的各突变位点中,仅A2059位点突变无适应性代价,甚至会提高突变菌株的体内适应性,但G2057、A2062位点的突变会产生高适应性代价。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.611
【参考文献】
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2375227
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