沙门菌生物被膜形成调控基因rpoE的鉴定及缺失突变株的生物学特性研究

发布时间：2019-01-07 20:47

【摘要】：沙门菌能够引起人和动物的感染,是一种常见的人兽共患病原体。在全世界范围内广泛流行,严重威胁人类健康,同时也给畜牧业及食品加工业带来巨大的经济损失。沙门菌能够形成生物被膜,生物被膜的形成使细菌对外界环境的抵抗力增强,从而不易被消毒剂和抗生素清除,导致细菌的持续感染和反复感染。沙门菌生物被膜形成主要是由RpoS蛋白调控的,但也存在RpoS蛋白非依赖型生物被膜形成株。本研究利用结晶紫染色定量法测定120株沙门菌分离株的生物被膜形成能力；通过触酶试验测定RpoS蛋白活性,确定rpoS基因依赖型和非依赖型生物被膜形成株；利用建立的荧光定量PCR方法比较rpoS基因依赖型和非依赖型生物被膜形成株在指数期和生物被膜形成期不同Sigma因子的基因表达差异；运用Red同源重组系统构建rpoE基因缺失株,并测定了缺失株的生物被膜形成能力和致病性,为进一步阐明沙门菌生物被膜形成的调控机制奠定了基础。1.沙门菌生物被膜形成相关Sigma因子的鉴定利用结晶紫染色定量法对120株不同来源的沙门菌进行生物被膜形成能力测定,通过接种于刚果红和考马斯亮蓝平板、荧光增白剂平板测定生物被膜成分,触酶试验测定生物被膜形成株的RpoS蛋白活性,最后利用建立的荧光定量PCR方法对6个Sigma因子在指数期和生物被膜形成期的基因表达量进行测定。结果显示,沙氏菌能在刚果红和考马斯亮蓝平板上生长出四种菌落形态,分别是红色干燥粗糙型、棕色于燥粗糙型、粉色干燥粗糙型和白色光滑型菌落。荧光增白剂平板在紫外线下的荧光强度与生物被膜中纤维素的含量成正比。75%的沙门菌能够形成生物被膜,其中rpoS基因非依赖型生物被膜形成株11株,rpoS基因依赖型生物被膜形成株79株。构建6个Sigma因子的重组质粒标准品,利用绝对定量绘制出6个Sigma因子的扩增标准曲线。选取3株代表株检测4-24h不同Sigma因子的基因表达量,结果显示rpoS基因非依赖型生物被膜形成株在24 h生物被膜形成时期rpoE基因的表达量显著高于其他5个Sigma因子。说明rpoE基因可能为rpoS基因非依赖生物被膜形成株中参与生物被膜形成的Sigma因子。2.沙门菌生物被膜形成相关Sigma因子缺失突变株的构建选取两株rpoS基因非依赖型生物被膜形成株鸡白痢沙门菌S6702和鼠伤寒沙门菌S016,以及一株rpoS基因依赖型生物被膜形成株鼠伤寒沙门菌S025。采用Red同源重组法分别构建rpoS和rpoE基因的缺失突变株,利用PCR、RT-PCR和回复试验鉴定证明6个基因缺失突变株构建成功。生长曲线测定显示,rpoS基因缺失株与野生株的生长速度无明显差异；在鸡白痢沙门菌S6702中,rpoE基因缺失株的生长速度高于野生株,而在鼠伤寒沙门菌S016和S025中,rpoE基因缺失株的生长速度低于野生株。结晶紫染色定量法测定缺失株的生物被膜形成能力结果显示,在rpoS基因依赖株S025中,rpoS基因缺失后不能形成生物被膜；在非依赖株S6702和S016中,rpoS基因缺失后仍能形成生物被膜。rpoE基因缺失后均不能形成生物被膜。回复试验结果显示,rpoS回复株与rpoE回复株和野生株的生物被膜形成能力类似。由此证明,rpoE基因为参与生物被膜形成新的Sigma因子。3.沙门菌rpoE基因缺失株的致病性研究对3株野生株S6702、S016、S025和6株基因缺失株(S6702△rpoE、S6702△rpoS, S016△rpoE, S016△rpoS, S025△rpoE, S025△rpoS)进行HeLa细胞的黏附和侵入试验以及HD11巨噬细胞内增殖试验。试验结果显示,缺失株△rpoS与野生株差异不显著；在鼠伤寒沙门菌中缺失株△rpoE与野生株相比黏附率、侵入率和增值率均有所降低,而在鸡白痢沙门菌中缺失株△rpoE的黏附率、侵入率和内增殖率均有所升高。1日龄SPF鸡致死性试验结果显示,缺失株△rpoS的LD50均与野生株相似。在鸡白痢沙门菌S6702株中,缺失株△rpoE的LD50有所下降；但在鼠伤寒沙门菌S016、S025株中,缺失株△rpoE的LD50均有所上升。细菌体内分布试验结果表明,经口攻毒12 h后,6株缺失株与野生株在各脏器之间的分布无明显差异。48 h时,鸡白痢沙门菌S6702中缺失株△rpoE比野生株在脾脏和胆汁中分布显著增多；鼠伤寒沙门菌中缺失株△rpoE比野生株在脾脏和胆汁中分布略有降低,但差异不显著。因此,rpoE基因对不同血清型沙门菌的致病性影响不一致。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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本文编号：2404143