【摘要】：异氟醚是临床常用的吸入麻醉剂,越来越多的研究发现异氟醚可诱发快速生长发育期动物的大脑神经元异常凋亡,并伴随有脑功能的长期损害。本课题组多年来一直致力于异氟醚神经毒性方面的研究,在异氟醚引发幼鼠行为学改变、诱导神经细胞凋亡等方面获得了较多的实验数据。近期又发现异氟醚在诱导细胞凋亡的同时伴有自噬现象发生。自噬和凋亡的复杂关系是当今研究领域的一个热点问题,明确自噬在异氟醚诱导的神经细胞凋亡中的作用及相关机制,将为进一步探讨麻醉毒性及其机制提供理论基础。因此本试验以7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象,结合自噬工具药的运用,明确自噬在异氟醚致幼鼠海马凋亡中的作用,并初步探讨异氟醚引起的凋亡与自噬之间的关系。试验选取120只7日龄SD大鼠,随机分为异氟醚(Isoflurane)麻醉组(ISO)、雷帕霉素(rapamycin,RAP)干预组(ISO+RAP)和3-甲基嘌呤(3-methyladenine,3-MA)干预组(ISO+3-MA)。ISO+RAP组和ISO+3-MA组在麻醉前30 min分别腹腔注射20 mg/kg RAP和20 mg/kg 3-MA。各组大鼠分别吸入1.5%异氟醚混合60%氧气0 h(CON)、2 h、3 h、4 h和6 h,CON组只吸入60%氧气6 h。采用苏木精-伊红(HE)染色、原位末端标记法(TUNEL)染色、免疫组化和蛋白印迹法(Western blot)等技术,从组织学和分子学角度探讨异氟醚诱导的自噬和凋亡之间的关系。试验结果如下:HE染色发现,对照组海马各区神经细胞元排列紧密,少有凋亡;ISO组在麻醉3 h后出现较明显凋亡;ISO+RAP组在麻醉4 h后出现较明显凋亡;ISO+3-MA组在各麻醉时间点均出现不同程度凋亡,在麻醉4 h和6 h时尤为严重。TUNEL染色显示:与对照组比,ISO组在麻醉3 h后凋亡明显增加;ISO+3-MA组在麻醉2 h后均有明显凋亡;ISO+RAP组仅在麻醉4 h和6 h时有明显凋亡。组间比较,ISO+RAP组在麻醉4 h(P0.05)和6 h(P0.05)时较ISO组细胞凋亡率显著降低;ISO+3-MA组在麻醉2 h(P0.05)、3 h(P0.05)和4 h(P0.05)时较ISO组细胞凋亡率显著增多。Cleaved-caspase-3蛋白印迹结果与TUNEL染色结果基本一致。LC-3 II免疫组化显示:与对照组相比,ISO组在麻醉3 h时阳性细胞比率较多;ISO+3-MA组LC-3 II阳性细胞比率较低,但在麻醉6 h时明显增加;ISO+RAP组则在麻醉3 h和4 h时有较多阳性细胞表达。LC-3 II蛋白结果显示:与对照组相比,ISO组在麻醉3 h后表达量显著增加;ISO+3-MA组在各麻醉时间点均无显著变化;ISO+RAP组在麻醉2 h、3 h和4 h时显著升高。组间比较,ISO+RAP组在麻醉2 h时表达量明显高于ISO组(P0.05),在麻醉2 h(P0.05)和3 h(P0.05)时显著高于ISO+3-MA组。Beclin-1变化趋势与LC-3 II基本一致。Bcl-2蛋白印迹结果显示:与对照组相比,ISO组和ISO+3-MA组在麻醉3 h后均有显著下降;ISO+RAP组仅在麻醉4 h和6 h时显著下降。组间相比,ISO组和ISO+3-MA组在麻醉3 h(P0.05,P0.05),4 h(P0.05,P0.05)和6 h(P0.05,P0.05)时均显著低于ISO+RAP组;在麻醉2 h时,ISO+3-MA组Bcl-2表达量显著低于ISO+RAP组(P0.05)和ISO组(P0.05)。本试验结果显示,1.5%异氟醚可诱发7日龄SD大鼠海马神经元发生自噬和凋亡,且自噬的出现早于凋亡。异氟醚诱导的神经细胞自噬对细胞凋亡有抑制作用,即异氟醚诱导的海马神经元自噬可降低其神经毒性,起到保护细胞作用。抑制自噬能加重异氟醚诱导的幼鼠海马神经元凋亡,而促进自噬能减轻异氟醚诱导的幼鼠海马神经元凋亡。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.7
【参考文献】
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