【摘要】：传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性传染病,主要易感动物为3-6周龄雏鸡,病毒感染后主要在法氏囊内增殖。该病不但能使感染动物死亡,还能产生免疫抑制,降低感染动物抵抗力,使其受其他病毒感染的风险增加。而且IBDV易变异,动物发病之后又难以根除,加上多种禽鸟类可带毒传播,给养禽业造成重大损失。及早进行疫苗免疫接种,及时了解鸡群IBDV抗体水平是防控该病的有效手段。因此本研究旨在从两个方向对IBD的防控进行研究,一方面利用慢病毒表达系统构建过表达gga-miR-9基因的DF-EGFP-miR-9细胞并进行纯化,检测细胞内IBDV表达的效率,探究其用于病毒生产的可能;另一方面利用昆虫细胞表达系统表达IBDVVP3蛋白,并对VP3蛋白的ELISA抗原反应性进行研究,探究VP3-ELISA用于检测鸡群IBDV抗体水平的能力。实验一:过表达gga-miR-9基因的DF-1细胞株的构建及纯化为研究过表达gga-miR-9基因的DF-1细胞对病毒复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的基因组中扩增出pri-gga-miR-9基因,插入到慢病毒载体质粒pL-EGFP中,构建重组表达质粒pL-EGFP-miR-9,并与pC-GP、pR-Rev和pVSVG三个包转质粒共转染293FT细胞,制备含gga-miR-9基因的重组慢病毒VL-EGFP-miR-9。将VL-EGFP-miR-9感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选纯化获得过表达gga-miR-9的DF-EGFP-miR-9细胞。荧光显微镜下观察,分选后DF-EGFP-miR-9细胞形态正常,细胞荧光强度和密度显著提升。用MTT法测定并绘制细胞的生长曲线,分选后DF-EGFP-miR-9细胞生长状态与正常DF-1无差异。qRT-PCR检测细胞中gga-miR-9的表达,结果表明分选后的DF-EGFP-miR-9细胞中gga-miR-9的表达量比未分选的gga-miR-9高40倍,比正常DF-1细胞高500倍。将IBDV接种于已分选的DF-EGFP-miR-9细胞,72h后收取上清检测病毒滴度,结果显示病毒滴度(109.25 TCID50/0.1mL)高于未分选细胞(108 TCID50/0.1mL)和正常 DF-1 细胞(106.875 TCID50/0.1mL)。本实验结果表明:经流式细胞术分选的DF-EGFP-miR-9细胞能稳定过表达gga-miR-9,还能显著提高培养产生的病毒滴度。实验二:传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDV vp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 阳性检出率低于 VP2-ELISA 和 IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 与 IDEXX-ELISA 的相关系数低于 VP2-ELISA 与 IDEXX-ELISA 的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA抗原反应性弱于重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA抗原反应性。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【参考文献】
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