猪流行性腹泻病毒基因变异分析以及间接ELISA诊断方法的建立

发布时间：2019-02-22 17:41

【摘要】：猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是猪的一种急性肠道传染病,该病病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。从2010年下半年起,猪流行性腹泻在我国南方十多个省份传播开来,且表现出发病率高、死亡率高的特点。近几年,我国不同地区流行的PEDV毒株之间的亲缘关系有一定的差异性,很多地区的流行毒株与传统疫苗株的亲缘关系较远,这给猪流行性腹泻的防控带来很大的困难。由于猪流行性腹泻与猪的一些其它腹泻性疾病,尤其是猪传染性胃肠炎,在临床症状和病理变化上都非常相似,根据临床症状和病理变化无法进行确诊,因此,急需建立一种快速、准确且易于在基层推广的诊断方法。本研究对2014年上海地区流行的9株PEDV毒株进行基因变异分析,为掌握上海地区PEDV的流行特点和上海地区PED的防控提供科学的依据。此外,还对PEDV的N蛋白进行原核表达,用表达的N蛋白作为抗原,建立了 PEDV间接ELISA诊断方法,为猪流行性腹泻ELISA试剂盒的开发提供了良好的理论基础。具体内容如下:1.2014年上海地区猪流行性腹泻病毒基因变异分析利用RT-PCR对2014年上海地区流行的9株PEDV毒株的S、M、ORF3基因进行扩增并进行序列测定。将测序结果与PEDV的参考序列用软件进行比对分析,并绘制出基因进化树。与CV777参考毒株相比,本研究中的9个毒株S蛋白的氨基酸序列均存在2处氨基酸的插入和1处氨基酸的缺失;在S蛋白的抗原表位区域COE和线性表位S1D6的核心序列SS6处,某些氨基酸发生了点突变;而在线性表位S1D5的核心序列SS2和线性表位2C10处完全保守;M蛋白的氨基酸序列有4处氨基酸发生了点突变;ORF3蛋白的氨基酸序列有7处氨基酸发生了点突变。S基因系统进化树显示本研究中的9个毒株与2013年美国的流行毒株和韩国2008～2009年的流行毒株的亲缘关系较近,而与我国目前主要的疫苗株CV777亲缘关系较远。M基因系统进化树显示本研究中的9个毒株与2013年美国的流行毒株、2007～2008年的泰国流行毒株和2007年的韩国流行毒株关系最近,而与我国目前主要的疫苗株CV777亲缘关系较远。ORF3基因的进化树表明本研究中的9个PEDV毒株与2007年韩国流行毒株和2013年美国的流行毒株亲缘关系较近,而与我国目前主要的疫苗株CV777亲缘关系较远。2.PEDVN蛋白的原核表达利用引物设计软件Primer 5.0设计出一对扩增PEDV N基因全长的引物,对2014年上海地区PEDV流行株的N基因进行扩增,并将其克隆到pET30a载体上,构建出重组原核表达质粒pET30a-N。将pET30a-N转入BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE检测,证实重组目的蛋白得到了有效表达,且表达的重组目的蛋白主要存在于包涵体中。将包涵体溶解、纯化、复性后进行Western-blot鉴定,鉴定结果表明目的蛋白与PEDV抗体反应性良好。3.PEDV间接ELISA诊断方法的建立用纯化好的重组N蛋白包被酶标板进行ELISA,通过一系列条件优化试验确定出各个反应条件,建立出PEDV间接ELISA诊断方法。用建立好的ELISA方法和BIOVET公司生产的猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒同时对92份临床血清样品进行检测,符合率达89.1%,符合率较高,说明此方法可用于血清样品的检测和流行病学调查。最后,用所建立的ELISA诊断方法对2014年11月份采集自上海地区15个规模化猪场的423份临床血清进行检测,PEDV抗体阳性率为41.8%。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

【参考文献】