布鲁氏菌外膜蛋白OMP25对MAPK信号通路的影响

发布时间：2019-02-23 18:19

【摘要】：布鲁氏菌病主要引起家畜的流产、死胎、睾丸炎等症状,给畜牧业的生产造成严重的经济损失。布鲁氏菌没有典型的外毒素,其毒力主要表现在对宿主细胞的侵袭力和自身繁殖力上。外膜蛋白是布鲁氏菌的主要毒力因子,与细菌的黏附和定殖密切相关。OMP25蛋白是布鲁氏菌中重要的外膜蛋白,在维持细菌自身结构的稳定性和展现细菌毒力上有重要作用,缺失OMP25蛋白后,布鲁氏菌的毒力明显下降。MAPK信号通路是普遍存在于真核细胞的信号转导通路,可以被病原菌、细胞因子等信号激活,产生应激反应。本实验旨在研究外膜蛋白OMP25与MAPK信号通路的关系,了解外膜蛋白对信号通路的激活情况,以及对细胞因子分泌的影响,为进一步研究布鲁氏菌的致病机制提供理论依据。围绕以上观点开展如下研究:筛选并鉴定布鲁氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋养层细胞时显著表达的细胞因子。建立布鲁氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋养层细胞模型,采用ELISA方法检测侵染后0 h,8 h,24 h,48 h的细胞上清液中的细胞因子,确定分泌量差异显著的细胞因子。结果显示,OMP25组、2308组和PBS对照组的IL-10,IL-1β在各个时间段的差异均不显著;在侵染4 h时,OMP25缺失株侵染组IL-1的释放量显著低于2308侵染组(P0.05);与2308组相比,OMP25组TNF-α的释放量在4 h,8 h,24 h,4 8h均差异显著。研究表明布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中外膜蛋白OMP25与细胞因子TNF-α的释放量密切相关。分析布鲁氏菌OMP25对MAPK信号通路的影响。建立布鲁氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)模型,收集侵染细胞总蛋白,定量后进行磷酸化检测。用浓度为10μM的信号通路抑制剂孵育细胞1 h,用牛种布鲁氏菌布鲁氏菌OMP25缺失株和强毒株2308以100:1的比例侵染细胞。ELISA法检测侵染细胞4 h,8 h,24 h,48 h后细胞上清液中的TNF-α的含量,进一步通过阻断实验对其进行验证。结果显示:在26个磷酸化的蛋白中,2308激活了GSK-3a/b、JNK、p38、P70S6Kinase、RSK2、HSP27磷酸化位点。OMP25缺失株激活了p38γ通路相关的蛋白磷酸化位点。抑制实验结果显示,加入p38抑制剂后,OMP25缺失株侵染组与2308侵染组TNF-α分泌量均降低;加入JNK和ERK抑制剂后,OMP25缺失株侵染组中TNF-α变化不明显。研究表明布鲁氏菌OMP25缺失株和布鲁氏菌2308株激活了MAPK信号通路中的p38支路,且TNF-α的产生和p38有关。检测布鲁氏菌OMP25缺失株和2308株感染小鼠时MAPK信号通路的激活情况,进一步阐述OMP25在MAPK信号通路激活机制的作用。采用腹腔注射法对雌性小鼠用布鲁氏菌OMP25缺失株和2308株进行感染,收集感染小鼠外周血,并通过血清检测Ig G和TNF-α的释放量,病理切片观察布鲁氏菌OMP25缺失株和亲本株2308对小鼠的影响,对布鲁氏菌侵染后影响的MAPK信号通路进行免疫组化分析。结果显示布鲁氏菌OMP25缺失株和2308株感染组小鼠后血清中TNF-α的释放量均低于对照组。病理切片结果显示与OMP25缺失株组相比,2308感染组出现明显的病理变化。免疫组化结果显示,OMP25缺失株和2308株侵染的小鼠子宫内膜均有MAPK信号通路p38支路和ERK支路的磷酸化。结果表明布鲁氏菌2308亲本株和OMP25缺失株均促进了TNF-α的表达,同时激活了MAPK信号通路p38和ERK支路。
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【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【参考文献】