猪流行性腹泻病毒对猪树突状细胞免疫功能的影响

发布时间：2019-03-10 18:28

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的主要病原体是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),它主要引起仔猪的临床病理特征是呕吐、水样腹泻和脱水。各生长阶段的猪均易感染PEDV,其中未断奶仔猪的发病率高达100%,十日龄以内的感染仔猪病死率为80%～100%。感染猪只虽然能够存活,但是抵抗力下降,会导致其他相关疾病的混合感染。该病的爆发流行对畜牧养殖业造成了严重的经济损失。PEDV的主要靶器官是仔猪小肠上皮,而在仔猪小肠上皮下广泛的分布着大量的树突状细胞(Dendritic cells,DCs),树突状细胞是目前已知的哺乳动物机体中功能最为强大的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),它不仅在监视和抵御病毒入侵的过程中起到重要作用,同时还可以激活机体的抗病毒免疫应答。本试验以体外分离培养的猪单核源树突状细胞(Monocyte derived dendritic cells,Mo-DCs)和肠道树突状细胞为主要研究对象,通过体外试验和体内试验验证PEDV弱毒株CV777及其灭活毒与仔猪树突状细胞的相互作用,以此来探讨PEDV弱毒株CV777及其灭活毒对仔猪树突状细胞主要免疫功能的影响,为研究PED的发病机制以及PEDV疫苗的研制奠定理论基础。1猪单核源DCs的体外分离培养和鉴定DCs作为哺乳动物体内功能最为强大的抗原递呈细胞,是唯一能够激活初始T细胞的一类异质性细胞。它对于调节免疫应答、连接先天性免疫和获得性免疫起到重要的纽带作用。但是,DCs在机体中的含量是极少的,这对于DCs的研究十分不利。所以建立一套成熟的体外分离、诱导、培养猪DCs的方法模型就显得十分重要。由于猪DCs没有特异性的表面标志,因此我们只能从分离得到细胞的细胞形态、相关表面分子的鉴定以及生物学活性三个方面综合起来对分离培养出来的树突状细胞进行鉴定。结果显示我们分离培养的细胞有典型的树突状细胞形态,我们选取的表面分子:SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ 的表达量分别可以达到58.95%、72.31%和13.39%,未成熟Mo-DCs经LPS刺激24 h后可分化发育为成熟Mo-DCs,成熟 Mo-DCs 的 SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+的表达量可以达到66.17%、81.16%和34.30%。同时在吞噬试验中未成熟、成熟DCs的结果也符合DCs的相关生物学特性,这些结果均表明本试验分离培养到了高纯度的猪单核源DCs,可以进行下一步的试验研究。2猪流行性腹泻病毒及其灭活毒对体外培养的猪单核源树突状细胞免疫功能的影响PEDV的主要靶组织是仔猪小肠上皮,而在仔猪小肠上皮下广泛地分布着大量的DCs,DCs不仅在监视和抵御病毒入侵的过程中起到重要作用,同时还可以激活机体的抗病毒免疫应答。为了探究PEDV及其灭活毒对猪DCs免疫功能的影响,我们用分离培养的仔猪单核源树突状细胞(Mo-DCs)与PEDV及其灭活毒共同作用,首先通过荧光定量和病毒滴度检测PEDV对Mo-DCs细胞是否感染,再用流式细胞术和ELISA检测PEDV及其灭活毒对选取的相关Mo-DCs细胞表面分子的表达量和细胞因子分泌量的影响,最后通过混合T淋巴反应试验验证Mo-DCs在PEDV及其灭活毒的作用下对T细胞增殖能力的影响。结果表明,PEDV可以低水平感染未成熟、成熟Mo-DCs,并且未成熟Mo-DCs的易感性要高于成熟Mo-DCs;与对照组相比,PEDV及其灭活毒可以显著的增加未成熟、成熟Mo-DCs表面分子CD1a~+、CD80/86~+和SLA-Ⅱ-DR~+表达量(P0.05);PEDV及其灭活毒可以使未成熟、成熟Mo-DCs分泌IL-12和IFN-γ显著高于对照组(P0.05);未成熟、成熟Mo-DCs在PEDV及其灭活毒的作用下能显著的刺激T细胞增殖(P0.05)。这些结果说明PEDV及其灭活毒可以显著提高Mo-DCs的抗原递呈、IL-12和IFN-γ的分泌以及刺激T细胞增殖的能力。3猪流行性腹泻病毒弱毒株及其灭活毒对仔猪肠道树突状细胞免疫功能的影响为了进一步验证PEDV及其灭活毒对仔猪DCs免疫功能的影响,我们通过体内试验对体外试验得到的结果进一步验证。本试验首先给仔猪进行肠结扎手术,向结扎肠段中注射PEDV及其灭活毒,通过免疫荧光和免疫组化的方法检测不同时间点仔猪小肠绒毛和固有层 SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T细胞的数量变化,从而验证肠道DCs在PEDV及其灭活毒作用后免疫功能的变化情况。结果显示:注射PEDV 3 h后,仔猪肠道固有层SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs数目显著增加(P0.05)。48 h之后,仔猪肠道绒毛上SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs 和 CD11b~+CD16~+DCs数目显著增加(P0.05)。这说明在仔猪受到PEDV感染早期,肠道中的SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ DCs和CD11b~+CD16~+ DCs会迅速经固有层向肠系膜淋巴结迁移,并且在持续感染中,机体通过增加小肠绒毛DCs来增强递呈抗原能力。而给仔猪注射PEDV及其灭活毒15 min、3 h和48 h时间点,小肠绒毛、肠道固有层中的CD3~+、CD4~+和CD8~+T细胞相比对照组均呈现出显著增加(P0.05)。这说明PEDV及其灭活毒可以通过增加肠道DCs递呈功能而显著刺激CD3~+、CD4~+和CD8~+ T细胞的增殖能力。为了进一步研究PEDV及其灭活毒对肠道DCs抗原递呈功能的影响,本试验给仔猪免疫PEDV及其灭活毒48 h后,用肠结扎手术向仔猪结扎肠段注射模式抗原-灭活大肠杆菌K88,用免疫荧光和免疫组化的方法检测仔猪小肠绒毛和肠道固有层SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T 细胞的数目变化。结果表明,注射灭活K88 3 h后,各组仔猪肠道绒毛内SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs的数量减少,而各处理组的仔猪肠道固有层SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+ DCs数量显著增加(P0.05),这说明仔猪小肠绒毛中的DCs可能已经向肠道固有层中进行迁移。而仔猪经PEDV及其灭活毒免疫48 h后再注射灭活K88 15 min和3 h,各处理组中仔猪小肠绒毛和固有层内CD3~+、CD4~+和CD8~+T细胞的数量均呈现显著增加(P0.05)。以上结果说明肠道树突状细胞在PEDV弱毒株CV777及其灭活毒的作用下,其抗原递呈和刺激T细胞增殖等免疫功能得到增强,这为研究PEDV的致病机制以及疫苗的开发提供理论基础。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

【参考文献】