大肠埃希菌外排泵基因oqxAB的流行及其耐药机制研究

发布时间：2019-04-04 09:14

【摘要】：喹乙醇作为喹VA啉-1,4-二氮氧化物的重要一员,因其具有良好的抗菌活性和促生长作用,在养殖业中被广泛使用,但耐药性也随之出现。2004年发现了质粒pOLA52上携带的耐药基因oqxAB,它由oqxA基因和oqxB基因组成,属于耐药结节分化家族(Resistance-nodulation-division family, RND家族),编码多重耐药外排泵。oqxAB不仅介导喹VA啉类药物耐药,还可降低细菌对氯霉素、喹诺酮类药物的敏感性,因此2009年oqxAB也被归为质粒介导的喹诺酮类药物耐药(Plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)基因。目前国内外关于oqxAB基因的流行病学及其耐药机制研究还较为匮乏。为了解oqxAB在大肠埃希菌(大肠杆菌)中的流行状况及其耐药机制,本研究调查分析了1993-2014年oqxAB及其它PMQR基因在我国大肠杆菌中的流行状况,对oqxAB+菌株进行PFGE分型和基因定位,探究它在我国流行率较高的原因。通过测定776株禽源分离株对喹嗯啉类药物(喹乙醇和乙酰甲喹)的最小抑菌浓度,分析基因型与耐药表型的关系；对特殊菌株进行基因定位和测序,试图解释出现特殊情况的原因；同时对oqxAB+供体菌和接合子进行耐药分析,研究oqxAB基因在细菌耐药中所起的作用,初步探索其耐药机制。1. oqxAB等质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在大肠杆菌中的流行状况本研究对1993-2014年1523株不同源大肠杆菌中PMQR基因进行了检测,发现PMQR基因具有很高的阳性率(33.3%),在所有的PMQR基因中,oqxAB阳性率最高,为26.1% (397/1523), aac(6')-Ib-cr和qnrS的阳性率次之(7.6%和6.0%),未检测到qnrC和qnrD基因,oqxAB的阳性率显著高于其它PMQR基因,尤其是在猪源分离株中阳性率可达51.9%。oqxAB还可联合其它基因一同存在,最常见的组合为oqxAB+aac(6')-Ib-cr,三阳性菌株中oqxA B+aac (6')-Ib-cr+qnrS也较为常见。猪源和禽源菌株中,oqxAB联合其它基因共存在的菌株数可占oqxAB阳性菌株数的23.0%和24.5%。本研究探讨了oqxAB高阳性率原因。选取70株oqxAB+菌株进行PFGE分型,结果显示除个别菌株外,大部分菌株遗传关系较远,耐药基因主要通过水平传播,人源菌株可通过不同的机会获得耐药基因。另对43株oqxAB+菌株进行S1-PFGE和Southern杂交, oqxAB多定位于易转移的大质粒上。耐药基因通过质粒水平转移的方式进行散播,可能成为oqxAB流行率高的重要原因。同时,oqxAB还可和其它PMQR基因一起位于同一质粒上,这种现象更促进了耐药基因的扩散,并可能会导致更容易筛选出高水平的耐药菌株,对人类健康造成威胁。分析1993-2014年间禽源菌株oqxAB阳性率、喹乙醇和乙酰甲喹耐药率的变化,二者均呈上升趋势,且1993-2004年这十年耐药率与oqxAB阳性率都无太大变化且维持比较低的水平。2005年农业部开始批准使用喹乙醇,2006年开始批准使用乙酰甲喹,于是从2005-2008年这阶段oqxAB阳性率和菌株耐药率开始迅速增长,到2014年都已达到或接近50%。虽然喹乙醇和乙酰甲喹的批准数量有下降趋势,但药物的累积作用对oqxAB基因流行所产生的影响不容小觑。2. oqxAB的耐药机制研究测定776株禽源大肠杆菌对喹乙醇和乙酰甲喹的MIC值,当喹乙醇和乙酰甲喹的MIC ≥256 μg/mL时,菌株全为oqxAB+菌株：当两种药物的MIC为128 μg/mL时,oqxAB+菌株所占比率分别为83.9%和96.3%；分离株对喹乙醇和乙酰甲喹MIC为64 μg/mL时,oqxAB+菌株的比例(78.2%和69.6%)显著高于oqxAB菌株(21.8%和23.2%),而当MIC为32 μg/mL时,oqxAB菌株的比例(93.0%和67.1%)显著高于oqxAB+菌株(7.0%和32.9%)。因此设定64 μg/mL为耐药临界点,MIC为32 μg/mL时为中介,μg/mL时为敏感。总体来说oqxAB+菌株对喹乙醇耐药或者中介的比例为98.6%,对乙酰甲喹耐药或者中介的比例为95.0%。oqxAB菌株对喹乙醇敏感或者中介的比例为91.9%,对乙酰甲喹敏感或者中介的比例为95.5%,阳性菌株的MIC50和MIC90显著高于阴性菌株,耐药表型和基因型基本一致。但分别有45株和25株oqxAB菌株对喹乙醇和乙酰甲喹表现耐药,3株和11株oqxAB+菌株对两种药物表现敏感。本研究对3株含有oqxAB但对喹乙醇和乙酰甲喹的MIC较低的菌株进行深入研究。通过S1-PFGE和Southern blot对oqxAB进行定位,其位于菌株的染色体上。又对oqxAB基因及其两翼序列进行测序,oqxAB基因序列与质粒pOLA52和克雷伯菌染色体序列同源性为96%-99%,oqxAB的侧翼序列与克雷伯菌基因组序列高度相似,在oqxA侧都有AraC转录调控家族。AraC转录调控家族可调节oqxAB的表达,这些菌株可能受到AraC的调节,使菌株虽然含有oqxAB基因但因其表达量下降而对喹乙醇和乙酰甲喹敏感。对实验室前期获得的接合子及其供体菌测定其对各类药物的MIC值,并测定供体菌QRDR突变。oqxAB可使受体菌获得对喹乙醇和乙酰甲喹的耐药性,并可使MIC达到供体菌的水平,而其它PMQR基因对这两种药物没有影响。对于喹诺酮类典型药物环丙沙星来说,oqxAB仅仅介导低水平的耐药,它可使接合子的MIC升高2-16倍,但与耐药临界点还相差很远。除了喹嗯啉类药物和喹诺酮类药物,oqxAB的转移还可使氨苄西林、四环素、氯霉素和庆大霉素的耐药性发生转移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【相似文献】