【摘要】：传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)为双病毒科双病毒属的病毒,可引起雏鸡感染的急性高致病性传染病传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),该传染病主要以免疫抑制为特征。该病毒上的VP2担当其主要的结构蛋白,构成IBDV衣壳的外层,可以诱导产生中和抗体,且具有血清型特异性。另外导致其毒力变异的重要因素也是由VP2高变区的氨基酸残基突变而引起的。因此VP2基因成为IBDV的免疫防制、遗传变异和繁殖机制的重要基因。IgY是存在于鸟类及爬行动物血清中的主要抗体。人们发现哺乳动物IgG Fc段可增加疫苗中抗原的血清半衰期,并增强抗原捕获的速度和效率,而对于与哺乳动物IgG相似结构及功能的禽IgY是否有类似功能目前鲜有研究。免疫佐剂因其可以激活先天免疫系统继而增强机体对特异性抗原的适应性免疫从而促使机体产生高效持久的免疫反应,所以在疫苗使用过程中占据重要的地位。本实验室前期前期结果表明泰山松花粉多糖(Taishan pinus massoniana pollen polysaccharide,TPPPS)具有良好的免疫效果,可作为优质免疫佐剂使用,但其对本研究中的融合蛋白的免疫增强效果情况还未有报道。因此,本研究探究了连接上IgY Fc的VP2融合蛋白是否能增强亚单位疫苗免疫原性以及泰山松花粉多糖对VP2-Fc融合蛋白的免疫效果的增强作用两大方面的问题。本研究根据Genbank发表的IBDV VP2基因序列和鸡IgY的Fc段基因序列,设计合成两对引物,利用SOE-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP2基因和IgY Fc的融合基因。将融合基因重组于pMD18-T中构建克隆质粒,经双酶切鉴定后再进行双酶切重组克隆质粒,将获得的VP2-Fc融合基因片段重组于pPIC9真核表达载体后经化学转化法转入毕赤酵母真核表达系统,筛选出阳性子进行培养并以甲醇为诱导剂进行诱导表达。分别于24h、48h、72h和96h取样,样本进行SDS-PAGE和Westem blotting等方法检测重组质粒表达量以及表达产物的免疫原性。结果表明,重组VP2-Fc融合蛋白具有免疫原性,毕赤酵母培养至72h时表达量最高。动物试验中,将240只SPF鸡随机分为6组,3日龄首免,分别颈部皮下接种0.2 m L VP2-Fc-TPPPS(40mg/mL)、VP2-Fc-TPPPS(25mg/mL)、VP2-Fc-TPPPS(10mg/mL)、VP2-Fc、VP2亚单位疫苗和PBS,于首免后7和14 d分别进行加强免疫。每组分别在首免后的3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49 d随机取3只鸡进行采血并检测其血清的抗体效价、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、外周血CD4+与CD8+T淋巴细胞含量以及T淋巴细胞的转化率。三免后1周,每组随机取20只鸡进行动物保护试验,连续7 d观察并记录临床症状和保护率。结果表明,VP2-Fc亚单位疫苗能有效诱导机体产生抗-VP2抗体,分泌IL-2、IL-4、IFN-γ,提高CD4+T、CD8+淋巴细胞百分含量和T淋巴细胞转化率,并能提供92%的保护率。此外,TPPPS佐剂疫苗能显著提高机体免疫反应水平。该研究为研发生产新型有效的IBDV亚单位疫苗及泰山松花粉多糖做免疫佐剂提供了理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
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