小鼠裸卵发育潜力及其来源的研究

发布时间：2019-05-06 23:57

【摘要】：卵母细胞发生、发育和成熟是现代生殖生物学研究的核心和基础,其中,卵母细胞的成熟是生殖发育研究的难点和重点。影响卵母细胞成熟的因素很多,其中卵母细胞周围的卵丘细胞是影响卵母细胞成熟的核心要素,裸卵是指周围未经卵丘细胞完整包裹的卵母细胞,尚未被利用,是一种潜在的卵源。裸卵体外成熟率及后续发育潜力较低。目前未见裸卵体外成熟获得个体的报道,这不仅制约着裸卵体外成熟培养的进一步发展,也制约着卵母细胞资源的充分利用。Forskolin能够抑制卵母细胞减数分裂的恢复,而PD166285能够推动MPF的合成,从而促进减数分裂的恢复。纺锤体的组装及皮质颗粒的分布可作为评价卵母细胞质量的指标。哺乳动物卵母细胞的发生,是一个极为复杂的细胞分化过程,易受到外界环境的影响。应激尤其是热应激对个体产生的最大问题之一就是它对生殖功能的损伤作用。但是热应激对卵母细胞质量,卵丘细胞包裹、凋亡情况以及裸卵的产生关系未见相关报道。因此,本研究以小鼠为研究对象,通过短时添加forskolin以抑制胞核成熟进程,再添加PD166285促进减数分裂恢复,观察forskolin及PD166285对卵母细胞成熟效率,并检测成熟卵母细胞的皮质颗粒分布及纺锤体组装,观察其对卵母细胞质量的影响。并通过IVF-ET进一步检测体外成熟裸卵的后续发育能力。并对小鼠进行热应激处理,通过苏木精伊红染色法及TUNEL细胞凋亡检测法观察卵巢上卵母细胞包裹的卵丘细胞的衰退与凋亡的情况,试图揭示热应激与小鼠卵巢内卵母细胞质量衰退,裸卵产生之间的联系。具体试验和结果如下:试验一目的是探讨添加forskolin及PD166285对裸卵成熟效率及皮质颗粒分布、纺锤体组装影响。将体外取得的未成熟的GV期裸卵随机分配为添加forskolin、PD及不添加两组。统计不同成熟方式下裸卵的成熟率,随后检测成熟卵母细胞纺锤体组装及皮质颗粒分布。结果发现,加药组不加药组均能完成体外成熟过程,加药组裸卵体外成熟率高于不加药组;对照组卵母细胞,其纺锤体呈对称的“纺锤形”。不加药组纺锤体结构松散,呈“桶状”分布,体内成熟组,皮质颗粒皮层分布模式所占比例显著高于体外成熟各组。以上结果说明,添加forskolin及PD166285能够提高裸卵的体外成熟率,并对成熟卵母细胞质量有一定提升。试验二旨在探明裸卵通过体外成熟受精后生产小鼠的可能。将卵巢上获取的裸卵体外加药培养成熟,并通过体外授精技术使其受精并发育到2-细胞期后,将2-细胞胚胎通过输卵管胚胎移植法移入假孕0.5dpc的受体雌鼠体内,并使其继续发育。我们通过本试验首次获得了由裸卵体外成熟受精生产出的小鼠。证明裸卵具有发育为个体的潜力。试验三旨在揭示热应激与小鼠卵巢内卵母细胞质量衰退及裸卵的产生之间的联系。将小鼠均分为HS-12d、HS-9d、HS-6d、HS-3d及CON五组,每组12只,分别对其进行频率和时间不同的高强度热应激。处理完成后,制作卵巢石蜡切片。利用HE染色及TUNEL细胞凋亡检测观察小鼠卵巢内卵母细胞个数及其包裹的卵丘细胞的衰退与凋亡情况。结果发现,对照组卵母细胞个数显著高于各热处理组,差异均显著(P0.05)。卵巢上周围卵丘细胞包裹2-5层的卵母细胞数量,对照组要显著高于其与各实验组(P0.05)。TUNEL凋亡检测显示,对照组凋亡率要显著低于各热应激处理组,差异均显著(P0.05)。结果表明,热应激会导致裸卵的产生。综上所述,本文通过裸卵体外成熟过程中与forskolin、PD166285共培养,发现添加forskolin及PD166285能够提高裸卵的体外成熟率,并对成熟卵母细胞质量有一定提升,同时证明纺锤体的组装及皮质颗粒分布可用于评价卵母细胞胞质质量。为后续提高裸卵的成熟率及卵母细胞胞质检测提供一定的参考。再通过体外受精-胚胎移植首次获得了由裸卵体外成熟受精得到的具有正常功能的后代小鼠。证明了裸卵在适当条件下也具有繁殖后代的潜能,为畜禽生产提供更为广阔的卵母细胞来源,同时也为治疗现代不孕不育提供一定帮助。并进一步研究了热应激对哺乳动物卵巢衰退及裸卵的产生、卵母细胞质量的影响,对裸卵的产生机理进行初步探讨。
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【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814

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