ALV-J体内感染诱导NLRP3炎症体和MDA5介导的天然免疫反应
发布时间：2019-07-11 09:00
【摘要】：J亚群禽白血病病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)属于反转录病毒,可以引起鸡免疫抑制和多发性肿瘤。由于ALV-J变异速度快,机体较难获得有效的免疫保护,目前尚无防治该病的有效疫苗。天然免疫是机体抗感染的首要防线,病毒入侵后会被天然免疫系统识别,进而引发相关免疫通路的活化和抗病毒反应。天然免疫识别受体中Nod样受体(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-Iike receptors,RLRs)在抗RNA病毒中发挥着重要作用。本研究对ALV-J感染早期时黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)及核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3炎症转导通路及调控机制进行探讨,为揭示ALV-J致病机制和宿主抗病毒免疫机制提供参考。首先,将本实验室分离的ALV-J临床株(命名为AJV-HF211)进行DF-1细胞增殖和鉴定,再将70只1日龄SPF鸡随机分为两组,攻毒组42只,对照组28只,经颈部皮下接种ALV-HF211细胞毒,0.2mL/只,2 x 104TCID50/mL,对照组接种细胞培养液,0.2mL/只。在感染不同天数后(days post infection,dpi)剖检观察病变,取肝脏制备石蜡切片。结果表明,攻毒组鸡胸腺出血、萎缩,肝脏和脾脏有出血点,胆囊萎缩、胆汁量少且呈淡黄色。此外,AJV-HF211毒株感染组织中炎性细胞增殖明显。其次,通过RT-PCR方法检测鸡肝组织中病毒的核酸片段并设计扩增MDA5、 NLRP3及其下游caspase-1及细胞因子IL-1β、1L-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特异性引物,进一步建立SYBR Green I实时荧光相对定量RT-PCR检测方法(RT-qPCR),分别检测感染组和对照组鸡肝组织内的MDA5、NLRP3及其下游接头分子和细胞因子的转录水平。RT-PCR检测ALV-J结果表明,在感染9dpi,首次检测到ALV-J特异性基因片段,且9-17dpi期间均能检测到该片段的存在。FT-qPCR结果表明,与未攻毒的对照组相比,AJV-HF211毒株感染可诱导鸡体内MDA5. NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β 和 IL-18基因的转录水平均有不同程度增加,而IFN-β和IFN-γ的表达无明显变化。其中,NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表达变化不明显,而在5-7 dpi时明显升高(p0.01),在9dpi开始下降；IL-1β、IL-18 在 1-5dpi无明显变化,在7-17dpi表达量明显升高(p0.05)。这表明炎症初期NLRP3转录水平显著增加,且变化趋势和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi时变化不明显,但在7-17dpi保持较高转录水平趋势。上述结果提示,NLRP3/ caspase-1炎症通路和MDA5受体在AJV-HF211感染早期可能发挥重要作用,而AJV-HF211毒株可能通过负向调控干扰素诱生机制逃逸免疫应答。最后,将鸡饲养至240日龄,观察肿瘤发生情况,并取肝脏组织制作石蜡切片,HE染色观察细胞状态。结果表明,AJV-HF211毒株感染部分鸡精神萎靡,食欲不振,羽毛蓬乱,伴有腹泻消瘦,贫血等症状；剖检观察到肝脏、心脏、卵巢均有实质性增生物出现。石蜡切片HE染色结果表明,攻毒组肝脏有明显的肿瘤灶,表现为髓细胞瘤和血管瘤。此外,还可见淋巴样细胞浸润,肝细胞索消失,细胞核崩解等病理变化。上述结果表明,本实验室AJV-HF211分离毒株经人工感染可对部分感染鸡具有致瘤性,其致瘤作用可能与鸡本身抗性有关。综上所述,AJV-HF211毒株感染早期和后期均可导致病鸡发生明显病变,并具有致瘤性。在感染早期时可诱导MDA5 及 NLRP3/caspase-1炎症通路的明显上调,但IFN-β 和 IFN-γ诱生受阻,这可能与ALV-J免疫逃逸有关。
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图片说明： 失ＲＩＧ－Ｉ［巧。基于鸡先天性缺失ＲＩＧ－Ｉ基因，ＲＩＧ－Ｉ或ＭＤＡ５缺陷小鼠都对ＲＮＡ逡逑病毒感染更敏感。一些研究者认为鸡会更容易感染ＡＩＶ，另外一些研究者则认为逡逑ＲＩＧ－Ｉ样受体家族的ＭＤＡ５会在功能上弥补这个缺失。有研究显示，ＭＤＡ５的逡逑大量表达可诱导ＩＦＮ－Ｐ的表达，且呈正相关口３］。逡逑７．１．１邋ＭＤＡ５介导的抗病毒信号通路逡逑ＭＤＡ５既可Ｗ识别单链ＲＮＡ又可识别双链ＲＮＡ病毒，当病毒侵入宿主细逡逑胞后，分别被ＲＩＧ－Ｉ和ＭＤＡ５识别，随后都必需通过定位在线粒体上一重要接逡逑头蛋白线粒体抗病毒信号分子ＭＡＶＳ（也称作ＩＰＳ－１、ＣＡＲＤＩＦ和ＶＩＳＡ）激活下游逡逑通路致使ＩＲＦ３发生x锼峄⒒罨汀＃停粒郑拥模文┒撕校茫粒遥慕峁褂颍殄义系剂擞耄遥蹋遥箦澹茫粒遥慕峁褂虻南嗷プ饔茫媚┒私峁褂蚴梗停粒郑佣ㄎ辉谙吡Ｌ逋忮义夏ど希吡Ｌ宥ㄎ欢裕停粒郑有惺构δ苤凉刂匾拧＃停粒郑诱心迹裕遥粒疲常心嫉藉义希停粒郑由系模裕遥粒疲撤⑸耍叮澄涣拥姆核鼗心疾⒓せ罴っ福裕拢耍焙湾义希桑耍耍槎裕桑遥疲常桑遥疲方衴酸化活化修饰，活化的ＩＲＦ３／ＩＲＦ７转移至细胞核，启逡逑动Ｉ型干扰素的产生（图巧。逡逑旅逦ＲＮＡ逡逑？ｖ腿邋＊？＞＊ｔｋ＊＞＊
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