慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用
发布时间：2019-07-18 17:16
【摘要】：将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图2荧光显微镜下观察mCherry荧光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T细胞转慢病毒重组表达载体与包装质粒；B：293T细胞转空载体与包装质粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids图3pAPN的RT-PCR检测（A）和pAPN的IFA检测（B）及对照细胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：阴性对照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol图1pAPN的扩增（A）和重组质粒的酶切鉴定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：pLVX-mCherry-APN双酶切产物；3：pLVX-mCherry-APN质粒未酶切产物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而对照的正常Vero细胞无荧光（见图3C）。2.4细胞系单克隆筛选和稳定性鉴定将Vero-APN按有限稀释法铺96孔细胞板，挑选含单个细胞团的细胞孔，IFA鉴定该细胞孔为阳性（见图4A、B），，将该阳性孔中细胞命名为Vero-APN-B6。对阳性孔中的细胞进一步扩大培养，分别取第5、15代的细胞进行IFA和Western-blot鉴定的结果（见图4C、D、E、F、G、H）表明，这些细胞均可稳定表达该蛋白。2.5Vero-APN-B6对PEDV易感性为研究Vero-APN-B6细胞株与正常的Vero细胞对PEDV的易感性差别，将TCID50为1×102.5和1×102.8
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图2荧光显微镜下观察mCherry荧光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T细胞转慢病毒重组表达载体与包装质粒；B：293T细胞转空载体与包装质粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids图3pAPN的RT-PCR检测（A）和pAPN的IFA检测（B）及对照细胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：阴性对照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol图1pAPN的扩增（A）和重组质粒的酶切鉴定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：pLVX-mCherry-APN双酶切产物；3：pLVX-mCherry-APN质粒未酶切产物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而对照的正常Vero细胞无荧光（见图3C）。2.4细胞系单克隆筛选和稳定性鉴定将Vero-APN按有限稀释法铺96孔细胞板，挑选含单个细胞团的细胞孔，IFA鉴定该细胞孔为阳性（见图4A、B），将该阳性孔中细胞命名为Vero-APN-B6。对阳性孔中的细胞进一步扩大培养，分别取第5、15代的细胞进行IFA和Western-blot鉴定的结果（见图4C、D、E、F、G、H）表明，这些细胞均可稳定表达该蛋白。2.5Vero-APN-B6对PEDV易感性为研究Vero-APN-B6细胞株与正常的Vero细胞对PEDV的易感性差别，将TCID50为1×102.5和1×102.8
【作者单位】： 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室;
【基金】：南京农业大学科研项目(KJQN201619)
【分类号】：S852.651
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图2荧光显微镜下观察mCherry荧光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T细胞转慢病毒重组表达载体与包装质粒；B：293T细胞转空载体与包装质粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids图3pAPN的RT-PCR检测（A）和pAPN的IFA检测（B）及对照细胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：阴性对照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol图1pAPN的扩增（A）和重组质粒的酶切鉴定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：pLVX-mCherry-APN双酶切产物；3：pLVX-mCherry-APN质粒未酶切产物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而对照的正常Vero细胞无荧光（见图3C）。2.4细胞系单克隆筛选和稳定性鉴定将Vero-APN按有限稀释法铺96孔细胞板，挑选含单个细胞团的细胞孔，IFA鉴定该细胞孔为阳性（见图4A、B），，将该阳性孔中细胞命名为Vero-APN-B6。对阳性孔中的细胞进一步扩大培养，分别取第5、15代的细胞进行IFA和Western-blot鉴定的结果（见图4C、D、E、F、G、H）表明，这些细胞均可稳定表达该蛋白。2.5Vero-APN-B6对PEDV易感性为研究Vero-APN-B6细胞株与正常的Vero细胞对PEDV的易感性差别，将TCID50为1×102.5和1×102.8
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图2荧光显微镜下观察mCherry荧光Fig.2ThemCherryfluorescenceinfluorescencemicroscopyA：293T细胞转慢病毒重组表达载体与包装质粒；B：293T细胞转空载体与包装质粒A：293TtransfectedpLVX-mCherry-pAPNandlentiviralpackagingplas；mBid：s293Ttransfectedemptyvectorandlentiviralpackagingplasmids图3pAPN的RT-PCR检测（A）和pAPN的IFA检测（B）及对照细胞（C）Fig.3DetectionofpAPNgenebyRT-PCR（A）anddetectionofpAPNinVerocellsbyIFA（B）aswellascontrolcells（C）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：阴性对照M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：Negativecontrol图1pAPN的扩增（A）和重组质粒的酶切鉴定（B）Fig.1AmplificationofpAPN（A）andidentifictionofre-combinantplasmidpLVX-mCherry-APNwithrestrictionenzymedigestion（B）M：DNA分子质量标准；1：pAPN扩增产物；2：pLVX-mCherry-APN双酶切产物；3：pLVX-mCherry-APN质粒未酶切产物M：DL5000DNAMarker；1：PCRproductfrompAPN；2：ProductsfrompLVX-mCherry-APNdigestedwithBamHI+XbaⅠ；3：pLVX-mCher-ry-APN3B），而对照的正常Vero细胞无荧光（见图3C）。2.4细胞系单克隆筛选和稳定性鉴定将Vero-APN按有限稀释法铺96孔细胞板，挑选含单个细胞团的细胞孔，IFA鉴定该细胞孔为阳性（见图4A、B），将该阳性孔中细胞命名为Vero-APN-B6。对阳性孔中的细胞进一步扩大培养，分别取第5、15代的细胞进行IFA和Western-blot鉴定的结果（见图4C、D、E、F、G、H）表明，这些细胞均可稳定表达该蛋白。2.5Vero-APN-B6对PEDV易感性为研究Vero-APN-B6细胞株与正常的Vero细胞对PEDV的易感性差别，将TCID50为1×102.5和1×102.8
【作者单位】： 南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室;
【基金】：南京农业大学科研项目(KJQN201619)
【分类号】：S852.651
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8 高慎阳;王s
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