产β-葡萄糖苷酶芽孢杆菌的筛选及水解大豆异黄酮糖苷研究
发布时间：2019-07-20 21:45
【摘要】：为获得能高效水解大豆异黄酮糖苷的芽孢杆菌,利用七叶苷平板分离法从动物的新鲜粪便中筛选产β-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌菌株,然后对酶活最高的菌株进行种属鉴定和水解大豆异黄酮糖苷的研究.结果显示:筛选到1株酶活力较高的芽孢杆菌R2-2,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);该菌株有较高的糖苷水解能力,黄豆苷水解率最高达到53.65%,染料木苷为48.80%.
【图文】：
的冰醋酸＋乙腈∶甲醇∶水＝３０∶１０∶６０（体积比）．２结果与分析２．１β－葡萄糖苷酶产生菌的筛选由于七叶苷（６，７－２－羟基－香豆素－β－Ｄ－葡萄糖苷）被β－葡萄糖苷酶分解会释放出七叶素（６，７－２－羟基－香豆素），七叶素能与Ｆｅ３＋反应形成黑色化合物，可依据菌落背面或周围显现黑色来筛选产β－葡萄糖苷酶的菌株，如图１．经纤维二糖培养基富集培养后，利用七叶苷分离培养基分离筛癣纯化获得１８株产酶较高的菌株．图１菌株筛选结果Ｆｉｇ．１Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｅｓｃｕｌｉｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ将初筛获得的菌株进行产酶发酵，提取粗酶液，按照酶活测定方法绘制葡萄糖标准曲线，测定菌株酶活，，进行复筛．葡萄糖标准曲线的线性回归方程及相关系数为Ｙ＝０．００９Ｘ＋０．００４，Ｒ２＝０．９９８．各菌株的β－葡萄糖苷酶活性见表１，选取酶活最高且产芽孢的Ｒ２－２进行后续研究．表１各菌株发酵液的β－葡萄糖苷酶活力测定结果Ｔａｂ．１Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆβ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｓｔｒａｉｎｓ菌株编号酶活／（Ｕ·ｍＬ－１）菌株编号酶活／（Ｕ·ｍＬ－１）Ｂ１－１０．１５６±０．０２５Ｃ３－３０．１７３±０．０２５Ｂ１－２０．１１０±０．０２０Ｒ１０．１２３±０．０２５Ｂ２－１０１３３±０．０２５Ｒ２－１０．２０７±０．０１５Ｂ３－１０．１８７±０．０３１Ｒ２－２０．２８３±０．０２５Ｂ３－２０．１７０±０．０
ａ．菌落；ｂ．菌体（×１０００）；ｃ．芽孢（×２０００）．图２菌株Ｒ２－２的菌落、菌体和芽孢Ｆｉｇ．２Ｃｏｌｏｎｙ，ｍｙｃｅｌｉｕｍａｎｄｓｐｏｒｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２表２菌株Ｒ２－２的菌落、菌体和芽孢的形态特征Ｔａｂ．２Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｌｏｎｙ，ｍｙｃｅｌｉｕｍａｎｄｓｐｏｒｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２项目形态项目形态菌落形状圆形菌体形态杆状菌落大小中偏小革兰氏染色＋菌落颜色白色，边缘灰色菌体大小（１．８２～１．９３μｍ）×０．６５μｍ菌落边缘不规则异染粒染色＋光学特性不透明芽孢形态圆柱形或椭圆形菌落表面干燥，有火山口芽孢着生位置端生或次端生＋代表阳性；－代表阴性．２．２．２１６ＳｒＲＮＡ基因序列测定、分析及系统进化树的构建经测定，菌株Ｒ２－２的１６ＳｒＲＮＡ基因序列的长度为１２７５ｂｐ．将基因序列提交ＮＣＢＩ数据库获得登录号ＭＦ０００３５０．与ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ数据库中的核苷酸序列进行在线同源性序列分析．采用ＭＥＧＡ．５软件进行多序列比对，用邻位连接法构建发育树（图３），结果显示菌株Ｒ２－２与Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ亲缘关系最接近．图３Ｒ２－２菌株１６ＳｒＲＮＡ基因序列系统发育树Ｆｉｇ．３Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２６２４河北大学学报（自然科学版）第３７卷
【作者单位】： 河北农业大学生命科学学院;
【基金】：河北省重点研发计划农业关键共性技术攻关专项(16226604D) 河北省技术创新引导计划科技型中小企业技术创新资金专项(15C1303121015) 沧州市科技支撑计划项目(161201007D) 保定市科学技术研究与发展计划项目(16ZN007)
【分类号】：S816
本文编号：2516924
【图文】：
的冰醋酸＋乙腈∶甲醇∶水＝３０∶１０∶６０（体积比）．２结果与分析２．１β－葡萄糖苷酶产生菌的筛选由于七叶苷（６，７－２－羟基－香豆素－β－Ｄ－葡萄糖苷）被β－葡萄糖苷酶分解会释放出七叶素（６，７－２－羟基－香豆素），七叶素能与Ｆｅ３＋反应形成黑色化合物，可依据菌落背面或周围显现黑色来筛选产β－葡萄糖苷酶的菌株，如图１．经纤维二糖培养基富集培养后，利用七叶苷分离培养基分离筛癣纯化获得１８株产酶较高的菌株．图１菌株筛选结果Ｆｉｇ．１Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｅｓｃｕｌｉｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ将初筛获得的菌株进行产酶发酵，提取粗酶液，按照酶活测定方法绘制葡萄糖标准曲线，测定菌株酶活，，进行复筛．葡萄糖标准曲线的线性回归方程及相关系数为Ｙ＝０．００９Ｘ＋０．００４，Ｒ２＝０．９９８．各菌株的β－葡萄糖苷酶活性见表１，选取酶活最高且产芽孢的Ｒ２－２进行后续研究．表１各菌株发酵液的β－葡萄糖苷酶活力测定结果Ｔａｂ．１Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆβ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｓｔｒａｉｎｓ菌株编号酶活／（Ｕ·ｍＬ－１）菌株编号酶活／（Ｕ·ｍＬ－１）Ｂ１－１０．１５６±０．０２５Ｃ３－３０．１７３±０．０２５Ｂ１－２０．１１０±０．０２０Ｒ１０．１２３±０．０２５Ｂ２－１０１３３±０．０２５Ｒ２－１０．２０７±０．０１５Ｂ３－１０．１８７±０．０３１Ｒ２－２０．２８３±０．０２５Ｂ３－２０．１７０±０．０
ａ．菌落；ｂ．菌体（×１０００）；ｃ．芽孢（×２０００）．图２菌株Ｒ２－２的菌落、菌体和芽孢Ｆｉｇ．２Ｃｏｌｏｎｙ，ｍｙｃｅｌｉｕｍａｎｄｓｐｏｒｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２表２菌株Ｒ２－２的菌落、菌体和芽孢的形态特征Ｔａｂ．２Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｌｏｎｙ，ｍｙｃｅｌｉｕｍａｎｄｓｐｏｒｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２项目形态项目形态菌落形状圆形菌体形态杆状菌落大小中偏小革兰氏染色＋菌落颜色白色，边缘灰色菌体大小（１．８２～１．９３μｍ）×０．６５μｍ菌落边缘不规则异染粒染色＋光学特性不透明芽孢形态圆柱形或椭圆形菌落表面干燥，有火山口芽孢着生位置端生或次端生＋代表阳性；－代表阴性．２．２．２１６ＳｒＲＮＡ基因序列测定、分析及系统进化树的构建经测定，菌株Ｒ２－２的１６ＳｒＲＮＡ基因序列的长度为１２７５ｂｐ．将基因序列提交ＮＣＢＩ数据库获得登录号ＭＦ０００３５０．与ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ数据库中的核苷酸序列进行在线同源性序列分析．采用ＭＥＧＡ．５软件进行多序列比对，用邻位连接法构建发育树（图３），结果显示菌株Ｒ２－２与Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ亲缘关系最接近．图３Ｒ２－２菌株１６ＳｒＲＮＡ基因序列系统发育树Ｆｉｇ．３Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｓｔｒａｉｎＲ２－２６２４河北大学学报（自然科学版）第３７卷
【作者单位】： 河北农业大学生命科学学院;
【基金】：河北省重点研发计划农业关键共性技术攻关专项(16226604D) 河北省技术创新引导计划科技型中小企业技术创新资金专项(15C1303121015) 沧州市科技支撑计划项目(161201007D) 保定市科学技术研究与发展计划项目(16ZN007)
【分类号】：S816
本文编号：2516924
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