猪轮状病毒VP3蛋白C端结构域的结构学研究

发布时间：2019-07-20 20:07

【摘要】：轮状病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹泻和呕吐为其主要引起的典型临床症状。轮状病毒的存在,不仅严重影响畜牧业的发展,同时也威胁到人类的安全,引起严重经济损失,成为科学研究的焦点。本研究将以猪轮状病毒(Procine Rotavirus,PRV)结构蛋白VP3的C端结构域(VP3-CTD)作为主要研究对象,通过结构生物学方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD对RV的致病性有重要影响。同时,该区域还具有2’,5’-磷酸二酯酶(2’-5’PDEs)的活性,可以通过切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-oligoadenylate synthetase,OAS)合成的2’,5’-寡腺苷酸(2’-5’A)来抑制OAS-RNase L信号通路,使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使机体发病。因此,通过研究PRV VP3-CTD的结构,可以进一步了解PRV的致病和免疫逃逸的机制,为抗PRV的药物的筛选奠定基础。本研究首先对猪轮状病毒VP3-CTD基因密码子进行优化,并将VP3-CTD基因克隆到原核表达载体p ET30a上进行原核表达纯化;在原核表达过程中对含有重组载体的Rosseta(DE3)表达条件进行优化,结果表明在0.5mmol/L IPTG、18℃、180rpm/min、18h的条件下目的蛋白的可溶性良好,获得了可溶性较高的蛋白;将表达的蛋白利用Ni2+柱亲和层析和分子筛层析进行纯化,并通过超滤法得到了高浓度、高纯度、非单体形式的VP3-CTD蛋白进行后续的蛋白结晶实验的蛋白结晶实验。在蛋白结晶条件筛选方面,本研究采用坐滴法进行筛选。通过多种条件的筛选,我们发现在HR2-110试剂盒的36号条件下(0.1mo/L Tris-HCl p H 8.5,8%PEG8000)蛋白结晶状况较好,最终通过进一步的优化得到晶体生长的最佳条件为0.15mol/L Tris-HCl p H 8.3、4%PEG8000、8%EG、60 days、20℃;在该条件下蛋白可以结晶成X射线衍射较强的规则长方体晶体,其晶体大小为15μm×15μm×200μm,通过X射线衍射实验得到晶体的分辨率为2.3?,并收取数据。利用分子置换法和多种晶体分析软件进行数据分析,解析出VP3-CTD的蛋白晶体结构。通过分析表明VP3-CTD是以同源二聚体的形式存在,其单体结构主要有2个α螺旋和7个β折叠组成,C端的β折叠形成一个凹槽,该蛋白的表面静电势显示,凹槽主要带正电荷,二聚体是两分子VP3-CTD蛋白的凹槽互补嵌合的结构,中间形成一个带较强正电荷的间隙,推测其为结合和切割带负电荷的2’-5’A的区域。总之,本研究通过表达和纯化PRV的VP3-CTD蛋白,并对其进行晶体结构的解析,进一步揭示了其切割2’-5’A的结构基础,为抗PRV药物的筛选提供理论依据。
【图文】：
成熟轮状病毒粒子结构模式（Prasadetal1988）

华中农业大学 2015 届硕士研究生学位论文造成大量的直接和间接经济损失。状病毒形态结构病毒（PRV）病毒粒子大体呈圆形，直径在 65 nm 和 75 nm 之间没有囊膜，中央是芯髓的核心，呈六角形（侯美如等 2013），核射状的光滑蛋白，排列成电子透明层（张镇松和刘秀卿 2009）。下观察其呈轮状结构的特征，，因此就命名该病毒为轮状病毒。P电子显微摄像技术，构建轮状病毒的三维结构模型，结构蛋白成外层衣壳，VP6 构成内层衣壳，VP1、VP2 和 VP3 三种结构蛋乔薪瑗 2008, 肖长峰等 2009），中央核心包裹 11 条病毒基因组髓的成分之一（图 1.1）（Prasad et al 1988）。
干扰素抗病毒分子机制（Hanetal2007）

图 1.2 干扰素抗病毒分子机制（Han et al 2007Fig.1.2 Anti-viral mechanism of IFNTD 蛋白抑制 OAS-RNase L 信号通路的研究毒的VP3-CTD蛋白具有2’-5’磷酸二酯酶活性，它能挥关键作用的 2’-5’A（仝文斌和陶其敏 1998,Loppase L 不被激活，病毒的 mRNA 和 rRNA 不被切割天性免疫系统的围捕，使宿主致病（图 1.3），并且变成精氨酸（VP3 H797R）后，2’-5’PDEs 活性明对 OAS-RNase L 信号通路的更精细的反应机2008, Han et al 2007）。而 PRV VP3-CTD 蛋白与人为研究 PRV VP3-CTD 结构和功能提供依据。晶学研究
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】