表达鸭坦布苏病毒E蛋白重组腺病毒的构建及对雏鸭的免疫效果研究

发布时间：2019-07-21 16:10

【摘要】：鸭坦布苏病毒病是鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的以产蛋下降、生长迟缓为主要特征的鸭新发传染病,肉鸭及蛋鸭均能感染该病。该病群内发病率能达到100%,死淘率为5%~15%。免疫接种是预防与控制该病的关键性措施之一,研制安全、有效,且能够有效区分疫苗免疫和野毒感染的新型疫苗对该病的防控至关重要。鸭坦布苏病毒囊膜蛋白E蛋白构成DTMUV的主要抗原表位,与病毒的吸附有关,诱导机体产生特异性中和抗体,引起保护性免疫反应。本研究首先构建了表达DTMUV E蛋白的重组腺病毒疫苗,并对其免疫效果的进行初步分析。根据鸭坦布苏病毒AH-F10株(GenBank登录号:KM102539)的E基因序列设计了一对特异性引物。提取鸭坦布苏病毒的RNA,并扩增目的基因。将目的基因连接至穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。将PCR、酶切及测序鉴定正确的重组穿梭质粒用Pac I酶线性化,之后与同样经Pac I酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E。将rAd-E感染AAV-293细胞,连续传代,均可产生明显细胞病变,表明rAd-E具有良好的遗传稳定性。检测第8代重组腺病毒滴度,TCID50为10-6.17/0.1mL。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,重组腺病毒可以在体外表达E蛋白,且该表达的重组E蛋白具有良好的反应原性。应用构建的表达E蛋白的重组腺病毒载体进行了免疫保护试验。将7日龄健康雏鸭随机分成4组,分别免疫重组腺病毒rAd-E,免疫剂量为108TCID50、鸭坦布苏病毒病AH-F10株油乳灭活苗(阳性对照),免疫剂量为0.5m L、wt Ad免疫剂量为108TCID50、PBS注射0.5mL,2周后用同等剂量加强免疫一次。免疫前后分别对各组试验鸭颈静脉采血,分离血清,进行DTMUV特异性抗体、中和抗体检测,同时分离外周血进行淋巴细胞增殖试验。二次免疫后2周进行攻毒保护试验。应用DTMUV AH-TL15野毒株攻毒所有雏鸭,攻毒剂量为0.5mL(ELD50为10-2.38/0.1mL)。记录发病及死亡情况,并剖检存活鸭只,制作病理切片。结果显示,重组腺病毒rAd-E免疫雏鸭后1周可诱导鸭坦布苏病毒特异性抗体的产生,抗体水平显著高于PBS组和wtAd组,但低于阳性对照组;中和抗体滴度最高达到1:16,低于阳性对照组,PBS组和wtAd组均未检测到中和抗体。淋巴细胞增殖试验结果显示rAd-E组的刺激指数最高,阳性对照组次之,且两组之间差异显著(P0.05);IL-4和IFN-γ蛋白含量也显著高于阳性对照组,表明重组腺病毒免疫组有效地诱发了细胞免疫反应。攻毒保护试验和HE染色结果显示阳性对照组雏鸭的保护率达到100%,重组腺病毒的保护率达到80%,PBS组和wtAd组雏鸭全部发病。阳性对照组和重组腺病毒组的各组织没明显病变,PBS组和wtAd组的肝脏空泡变性、脾脏和胰脏淋巴细胞浸润、脑组织有血管周围袖套,有噬神经细胞现象。说明重组腺病毒载体疫苗对鸭坦布苏病毒有较好的保护作用。综上所述,构建的表达E蛋白的重组腺病毒rAd-E,能诱导健康鸭产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且对野毒攻毒有较好保护雏鸭抵御DTMUV感染。研究结果为DTMUV感染防控及其基因工程疫苗的研究提供重要参考。
【图文】：

腺病毒 DNA 复制的起始时间，基因组分为早期基因(E)和晚期基是腺病毒复制的必需基因，是病毒基因活动的起始因子；E2 区与区为复制非必需区；E4 区编码产物与与病毒 DNA 复制相关。晚期要是病毒的结构蛋白[72]。毒的 E1、E3 和 E4 区的上游区域能够插入外源基因而不影响病2]。如今的腺病毒载体通过改造，包装容量大，且细胞毒性弱。动子，能使得外源基因高效表达，而且表达的蛋白进行翻译后，一定的空间形态[73, 74]，因此免疫效力较高。毒作为载体有以下优点：(1)由于是复制缺陷性载体，，目的基因在游离状态下表达，安全性好；(2)腺病毒结构及特性已研究清楚，操作；(3)宿主范围广，可感染分裂期或非分裂期细胞和组织，且Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structurereamstime.com/royalty-free-stock-images-structure-adenovirus-vector-diagram-morphology-as-most-commonly-cause-respiratory-illness-upper-respiratory-tract-image34731829）Fig. 1-2 Diagram of adenovirus structure图 1- 2 腺病毒结构示意图
E基因的PCR扩增

2 结果与分析组腺病毒的构建结果E 基因的扩增结果取鸭坦布苏病毒 RNA，以设计的 E 基因引物进行扩增后。获得到 1 条，与预期大小相符（图 2-1），测序鉴定结果与目的序列一致。重组穿梭质粒的酶切鉴定结果测序正确的片段与穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA分别用EcoR I和B凝胶回收纯化后进行连接，将连接产物转化至 DH5α中，挑单菌落提取质粒，用EcoR I和BamH I酶切鉴定，可见2条大小分别为6200b片段，符合预期（图 2-2），表明重组穿梭质粒 pacAd-E 构建成功。bpM 1bpM 1
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.32

【参考文献】