检测水貂阿留申病Dot-ELISA方法的建立及初步验证

发布时间：2019-07-29 15:20

【摘要】：水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)引起的一种持续性病毒性传染病。ADV感染幼貂后可引发严重的急性间质性肺炎,死亡率极高;而成年水貂感染ADV后则会形成持久性感染,症状表现为肾小球肾炎,浆细胞增多,高丙种球蛋白血症,动脉炎,生殖性能减退和自发性流产,给全球的水貂养殖业造成了严重的经济损失。由于该病致病机理特殊,至今未研制出有效的疫苗制剂,只能通过多种诊断方法筛选和淘汰病貂,达到根除疾病的目的。虽然该病的诊断方法较多,但大多数都不适合基层单位使用,即使是应用最广的对流免疫电泳(CIEP)法,也因其耗时长和易散毒的缺点,限制了其在基层的推广应用。目前迫切需要建立一种更为安全简便,且能广泛应用于基层单位的诊断方法。Dot-ELISA方法除了具有常规ELISA的优点外,还具有用量少,操作简便,不需要任何仪器、成本低廉,结果易判断且能长期保存等优点,非常适用于现场检测。本试验应用PCR技术从ADV-G中扩增出VP2全长基因和VP2截短基因;通过重叠延伸剪接技术将VP2截短基因与本实验室已验证的,具有良好反应原性的两段NS1截短基因(NS1-2和NS1-3)进行融合,获得两段融合基因SPb和SPc;将VP2全长基因、VP2截短基因以及两段融合基因SPb和SPc分别与克隆载体pMD18-T连接,构建重组克隆质粒并对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定;将鉴定后的重组克隆质粒进行双酶切,并与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建重组表达质粒,进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序;将鉴定后的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21,探索目的蛋白的最优表达条件,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;SDS-PAGE结果显示4段表达蛋白均与预期大小相符,Western blot结果显示每段蛋白均能被貂抗ADV阳性血请识别,具有良好反应原性;分别对表达的4段蛋白和NS1全基因蛋白、NS1-2蛋白、NS1-3蛋白(实验室之前构建的NS1截短表达蛋白)进行纯化,再以7种纯化蛋白作为包被抗原分别建立Dot-ELISA方法;将所建立的Dot-ELISA方法与CIEP进行对比。通过对比分析可知,各抗原的Dot-ELISA方法敏感性均高于CIEP,而与其它抗原相比,融合抗原SPc作为包被抗原所建立的Dot-ELISA方法敏感性高,特异性强。
【图文】：

ADVVP2截短基因PCR扩增结果

结果P2 截短基因，经 1%琼见图 1-2。1-1 ADV VP2 基因 PCR 扩regram of the VP2 gene amp子质量标准；1：VP2基因ker；1：PCR product of VP
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.92

【参考文献】

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本文编号：2520586