【摘要】：热应激引起雄性生殖器官功能损伤,导致精子活力、顶体完整率下降和精子畸形率升高,使精液品质和繁殖能力降低。同时热应激会引起睾丸组织活性氧的产生和代谢的不平衡,从而诱导睾丸氧化应激。锌作为一种重要的微量元素,不仅具有促生长和抗氧化作用,同时也具有生殖保护作用。本研究以雄性小鼠和巴马小香猪为研究对象,对其进行预饲添加不同锌浓度日粮,继而进行热暴露处理,通过观察各组小鼠、巴马小香猪睾丸组织的显微结构,检测分析睾丸组织的抗氧化水平、Cu-Zn SOD蛋白、Nrf2-Keap1/ARE通路中相关基因以及与自噬相关的P62蛋白、基因的表达变化,研究日粮锌对热暴露引起的雄性小鼠和巴马香猪生殖损伤的保护作用,为全面评价日粮锌对生殖损伤的保护机制提供科学的理论依据。主要研究如下:1、日粮锌对热暴露小鼠睾丸损伤的影响选用24只8周龄的ICR雄性小鼠,随机分为2组,每组12只。饲喂正常锌和添加锌250 mg/kg两种锌浓度的饲料,自由采食和饮水。饲喂一个月后,每组随机选取6只进行连续8 d,每天2 h,40-42℃的全身热暴露,并在每天热暴露后称其体重及采食量。最后一次热暴露后,采集各小鼠的睾丸组织样品进行形态学观察、抗氧化指标的测定以及Cu-Zn SOD、Nrf2蛋白的表达。试验结果表明,各组小鼠间体重、平均日增重均没有显著性差异(P0.05),平均日采食量在正常锌热暴露组显著降低(P0.05),但在加锌热暴露组中显著升高(P0.05);睾丸指数在正常锌热暴露组中显著提高(P0.01),同时在加锌热暴露组中显著下降(P0.01);热暴露组睾丸组织结构不完整,生精小管脱落,排列不整齐;睾丸组织Cu-Zn SOD含量在正常锌热暴露组中显著降低(P0.01),而H202、GPX和γ-GCS含量在各组间均无显著性差异(P0.05);Western blot结果显示,正常锌组在热暴露后,睾丸组织中Cu-ZnSOD蛋白表达量极显著降低(P0.01),加锌热暴露组也降低其表达,但极显著的高于正常锌热暴露组(P0.01);睾丸细胞核Nrf2蛋白表达量与正常锌非热应激组相比,热暴露组,加锌组以及加锌热暴露组中都极显著地升高(P0.01)。上述试验结果表明,热暴露引起雄性小鼠睾丸组织产生氧化损伤,同时,加锌可通过激活Cu-ZnSOD缓解这种损伤。2、日粮锌对热暴露巴马香猪生长性能的影响选用24头6月龄的雄性巴马小香猪,随机分为2组,每组12头。饲喂正常锌和添加锌1500 mg/kg两种锌浓度的饲料,自由采食和饮水。一个月后每组随机选取6头进行连续8d,每天5h,40℃的全身热暴露,并在热暴露的第1、4和8天对所有香猪进行颈动脉采血以及体重、采食量的统计。最后一次热暴露后,采集血液及各脏器,进行锌含量、血液生化指标及激素的测定。试验结果显示:加锌使体增重、平均日增重和饲料转换率都显著升高(P0.05);加锌组猪的脾脏指数显著低于正常锌组(P0.05),但其他脏器指数都无显著性变化(P0.05);在1500mg/kg加锌组中,血清、心脏、肾脏、睾丸、附睾、毛发、背最长肌和粪便中锌的含量显著升高(P0.05),同时热暴露血清中锌的含量显著低于非热应激组(P0.05);热暴露第1天,与非热暴露组相比,正常锌热暴露组血清睾酮水平极显著升高(P0.01)。上述结果表明,预饲额外添加锌1500mg/kg的饲料,可一定程度地缓解热暴露引起的巴马香猪血清锌浓度的降低,并提高生产性能。3、日粮锌对热暴露巴马香猪睾丸氧化损伤的保护机制选用24头性成熟的雄性巴马小香猪,随机分为2组,每组12头。饲喂正常锌和添加锌1500mg/kg两种锌浓度的饲料,自由采食和饮水,饲喂一个月后,每个浓度随机选取6头进行连续8 d,每天5 h,40℃的全身热暴露。最后一次热暴露后,采集睾丸组织。试验结果显示:正常锌组热暴露后,MDA水平显著升高(P0.05),加锌热暴露组中Cu-ZnSOD显著低于非热暴露组(P0.05);HE染色结果显示正常锌热暴露引起生精小管脱落,间质轻微松散;免疫组化结果显示加锌可显著增强睾丸间质细胞中AR、Cu-ZnSOD和P62蛋白的表达,同时热暴露会减弱前两者的表达量,但热暴露和加锌都可使P62蛋白表达显著增强;热暴露使Nrf2的调控基因NQO1和GCZCmRNA表达水平在正常锌组中极显著升高(P0.01),而加锌并不影响其表达量,但加锌热暴露可引起P62mRNA水平极显著升高(P0.01)。上述结果表明,饲喂1500 mg/kg加锌日粮可通过激活Nrf2-Keap1/ARE通路,一定程度地缓解热暴露引起的睾丸氧化损伤,但可能导致自噬紊乱。
【图文】：
图１－２哺乳动物氧自由基的一般清除路径逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｃｏｍｍｏ打邋ｏｘｙｇｅ打邋ｒａｄｉｃａｌ邋ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ邋ｉｎ邋ｍａｍｍａｌｉａｎ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑睾丸间质细胞的调ｔ逡逑间质细胞的主要生理功能是分泌雄性激素，且对热应激非常敏感应激会降低间质细胞类固醇激素的分泌，甚至会导致细胞本身死胞通过细胞连接给精细胞提供营养和结构的支持，当睾丸进行４３‘Ｃ细胞核精细胞之间Ｗ及支持细胞之间出现很多大的液泡，并且在热细胞连接被破坏，同时还伴随着雄激素受体ＡＲ基因表达的降低改变间质细胞和支持细胞的功能，进而影响精子的生成。逡逑ｅａｐｌ－ＡＲＥ信号通路及自佽逡逑／Ｎｒｆ２／ＡＲＥ（Ｋｅｌｃｈ－Ｕｋｅ邋Ｅｃｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ－１，邋Ｋｅａｐｌ；邋ＮＦ－Ｅ２－ｒｅｌａｔｅｏｘｉｄａｎｔ邋ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ邋ｅｌｅｍｅｎｔ，邋ＡＲＥ）信号通路是机体抵抗内外环境应
Ｋｅａｐ邋１邋（Ｋｅｋｈ－ｌｉｋｅ邋ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋４邋结合，抑制使活性。逡逑Ｎ泡由２．２化的碱基对编码，含６个功能区，分别为Ｎ}１、Ｎｅｈ２、Ｎｅｈ３、Ｎｅｈ４、逡逑Ｎｅｈ５和Ｎｅｈ６邋（图１－２）。另外Ｃ－^~基端的Ｎｅｈｌ是一条含７个亮氨酸重复序列的高度逡逑保守的碱性亮氨酸拉链（ｂＺＩＰ）结构，因其与小Ｍａｆ蛋白（ＭａｆＦ，ＭａｆＧａｎｄＭａｆＫ）逡逑结合，所Ｗ邋ｂＺＩＰ结构有助于其二聚化与ＤＮＡ结合，特别是与抗氧化反应元件ＡＲＥ逡逑结合Ｐ０，５ｉ］。Ｎｅｈ２位于Ｎ末端，是Ｎｒ亿与Ｋｅａｐｌ结合的区域，从而保持Ｎ泡处于无逡逑活性状态。Ｎｅｈ３位于Ｃ末端，对Ｎｒｆ２的转录活性非常重要Ｎｅｈ４和Ｎｅｈ５结构域逡逑主要功能是激活Ｎｒ亿下游祀基因的转录，，Ｎｅｈ６结构域的功能尚不清楚，但是有研究逡逑表明可能与Ｎｒ巧被降解有关Ｋｅ巧１是一种蛋白伴侣分子，存在于胞质中。主要逡逑含有ＢＴＢ／ＰＯＺ，ＩＶＲ和ＤＧＲ邋Ｈ个区域，其中ＤＧＲ负责Ｋｅ巧１和Ｎｒｆ２的结合，同时逡逑Ｋｅａｐｌ通过ＩＶＲ上的两个半腕氨酸残基是氧化和亲电子应激的传感器
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816
【参考文献】
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本文编号：
2522045
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