基于iTRAQ技术对奶牛金黄色葡萄球菌人工诱导型乳腺炎差异表达蛋白质分析

发布时间：2019-08-02 14:57

【摘要】：乳腺炎是奶牛场造成奶生产下降和巨大经济损失的一种复杂的奶牛疾病,严重地危害了奶牛业的健康发展,而金黄色葡萄球菌型乳腺炎足最严重的一种,治疗成本大且难以治愈。目前仍未找到彻底解决的方法。本研究利用金黄色葡萄球菌构建中国荷斯坦奶牛乳腺炎疾病模型,采用iTRAQ技术结合液质联用技术,筛选与奶牛金黄色葡萄球菌型乳腺炎密切相关的差异表达蛋白,并进行相关的GO和Pathway等功能分析,从而得到与奶牛乳腺炎相关的新型生物标记分子,以期初步从蛋白质水平揭示奶牛乳腺炎的免疫调控机制。主要结果如下：1.本实验成功的建立了奶牛临床型金黄色葡萄球菌型乳腺炎疾病模型,感染后奶牛所表现的临床症状及各项指标的检测(SCC, BMT等)结果,真实地反映了金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺炎的发病过程。2. iTRAQ技术分析共筛选到168个差异蛋白(Fold change≥1.5或者0.667,P0.05),其中66个在金葡菌组表达上调,102个表达下调。生物信息学分析发现有30个差异蛋白与乳腺组织的防御,免疫和炎症反应有关。3.差异蛋白的GO富集分析发现,这些蛋白显著富集到314条GO Term中(P0.05)。4.结合KEGG数据库对差异表达蛋白进行Pathway富集分析,筛选到20条与防御,免疫和炎症相关的通路。主要有：FC小量RI信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、B细胞受体信号转导通路、钙信号通路、Toll样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、血管内皮生长因子信号转导通路、白细胞跨内皮迁移、造血细胞谱系、肠道免疫网络的IgA生产、趋化因子信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、细胞质DNA的检测途径、FcγR-介导的吞噬作用、补体及凝血级联反应、T细胞受体信号转导途径、RIG-I样受体信号通路、NOD样受体信号通路、抗原加工和呈递。进一步对这些Pathway进行网络图分析,发现了12个枢纽蛋白：预测：血小板碱性蛋白、间α胰蛋白酶抑制物重链H3前体(IHIH3)、热休克蛋白β-1(HSPB1)、热休克70KDa蛋白1A(HSPA1A)、核因子NF-k-B P105亚基(NFKB1)、脂多糖结合蛋白(LBP)、Ras相关C3肉毒素底2前体(RAC2)、预测：copine-3亚型X1、isochcrismatase结构域蛋白1(ISOC1)、未鉴定的蛋白L oc524810前体(LOC524810)、整合素a-M前体(ITGAM)、整合素β-2前体(ITGB2)。可以初步将这些关键蛋白作为乳腺炎抗性选择的候选蛋白进行深入的研究。
【图文】：

金黄色葡萄球茵（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ，金葡茜），是一种革兰氏阳性球茵，厚壁菌口细逡逑菌的成员，广泛分布于自然界，显微镜下排列成葡萄串状，无芽抱、鞭毛，大多数无英膜，逡逑为需氧或兼性厌氧菌，为人畜共患型病菌（图１－１）。该菌株经常通过产生有效的蛋白毒素逡逑促进感染，并产生细胞表面蛋白结合和灭活抗体。由于抗生素的大量使用甚至滥用，＾使逡逑金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性菌株出现，成为临床医学需要攻克的一个世界性的难题。逡逑图１－１金黄色葡萄球稍逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ逡逑２．２金黄色葡萄球菌型乳腺炎发病机理逡逑金黄色葡萄球菌是诱发乳腺炎的主要病原菌之一，它所诱发的乳腺炎达到３０％邋Ｗ上，逡逑可产生破坏细胞膜和直接损伤产奶组织的毒素。最初，细菌破坏乳头管壁和乳腺池，导致逡逑形成疮痕组织。随后细菌再向上移动进入管道系统，，在泌乳细胞（腺泡）形成深层次感染。逡逑

图１－２邋ｉＴＲＡＱ试剂标签结构图（引自欧易生物医学）逡逑Ｆｉｇ邋１－邋２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉＴＲＡＱ邋ｒｅａｇｅｎｔ逡逑汀ＲＡＱ技术的主要操作流程如下（图１－３）包括：样品蛋白质的提`e蛋白质样品的酶逡逑解，酶解片段进行标记后混合，多维色谱分离，液相串联质谱鉴定，从而分离和鉴定不同逡逑来源样品的蛋白。逡逑？回＆＊？逦ｎｉｆｔＵ逦＾逦＇ｒ－邋＇Ｓ＇逡逑矮换泉气６＜ｒ．回倒煖ｐ逦Ｉ邋ｒａ逡逑－５ｏ＜ｒ．邋ｅＭ３＇？－逦，，．邋ｌｉｉ．逦，■逦逡逑、５逦％逦＼？ＵＭ邋ｔ？＊＊ｊ逦＊？、《逦Ｃ》１Ｕ逦１２１．逡逑0逦，．逦＿＿邋二逦＾？＾－－＾＂＊＊＊＂＊＊＊＊＊＊＇＾＊＊＂＾逦Ｉ邋Ｉ邋ｌａＪ叫ｕｌ—逡逑~T一‘？逦呵＊＇於＇？逦、．邋Ａ—－－－＇．－■＊邋邋邋＇．…＊逡逑图１－３汀ＲＡＱ原理和流程图（引自舜百生物）逡逑Ｒｇ邋１邋－３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ａｎｄ邋ｗｏｒｋｆｌｏｗ邋ｏｆ邋ｉＴＲＡＱ逡逑近年来，ＩＴＲＡＱ技术已成为研究蛋白质组学定性和定量研究的主要工具么一，其作逡逑巧已经在许多生物体和组织研究中得到证明ＷＷＷ，其优越性也在逐步地凸显，主要体现逡逑在Ｗ下几个方面：（１）定量精度高、标记完全。ｉＴＲＡＱ技术通过对标记蛋白进行串联质逡逑谱的峰值的比较来定量，与传统的双向电泳相比，其结果相对客观且精确性好。另外，由逡逑于试剂可Ｗ标记任何化段
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23

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本文编号：2522185