【摘要】：卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)作为现代生物技术如体外受精、胚胎工程、转基因克隆等技术的基础,可充分利用哺乳动物卵巢表面大量的未成熟卵泡中卵母细胞,改善胚胎体外生产效率,有助于提高动物生产。但是,体外培养的成熟的猪卵母细胞经体外受精以及细胞核移植后,胚胎发育都不如体内发育成熟的卵母细胞,其培养体系仍待进一步完善。WNT信号通路在进化中高度保守,在细胞的增殖、分化、凋亡、干细胞维持以及胚胎发育等方面都具有重要的作用。有研究表明WNT信号在雌性性腺发育过程中扮演关键角色。但WNT信号通路对于猪等大型家畜卵母细胞体外成熟的作用和机理国内外的研究很少。本研究以猪卵母细胞为研究对象,探索WNT信号通路受体Frizzleds家族在猪卵巢中的表达与定位,筛选出猪卵巢中高表达量的受体。分析Frizzleds受体家族在哺乳动物猪卵母细胞中的时序表达,揭示WNT通路对于哺乳动物卵母细胞发育的影响。同时,通过添加小分子抑制剂WNT-C59阻断WNT上游通路检测其对卵母细胞体外成熟培养的影响,从而为阐明猪卵母细胞体外成熟发育中WNT/Frizzleds信号通路的具体功能和机制提供参考。研究主要获得如下结果:1.WNT通路受体家族Frizzleds在猪卵巢中的表达差异根据Gen Bank中所保存的猪的不同Frizzleds基因序列,本试验运用实时定量PCR技术分析了Frizzled2-Frizzled7、Frizzled9和Frizzled10 mRNA在猪卵巢相对表达水平。结果表明,卵巢组织中Frizzleds家族mRNA表达水平顺序为:Frizzled5Frizzled7Frizzled4≥Frizzled3≥Frizzled2≥Frizzled6≥Frizzled9≥Frizzled10。即Frizzled5基因表达明显高于其他Frizzleds家族成员的表达量(p0.05)。其中,Frizzled7表达相对较高,明显高于Frizzled9和Frizzled10(p0.05)。其他家族成员表达无明显不同(p0.05)。Frizzled10几乎未表达。试验由此揭示Frizzleds家族在猪卵巢中普遍表达并筛选出家族中表达量最高的受体Frizzled5。2.Frizzled5受体在不同直径卵泡的表达及其在猪卵巢上的定位试验通过实时定量PCR和免疫组织化学的方法,检测了Frizzled5基因在不同直径大小卵泡中的表达,以及Frizzled5蛋白在猪卵巢上的定位。实时定量PCR结果表明,Frizzled5在小卵泡(2 mm)中的表达量明显低于中型卵泡(2 mm≤d≤5 mm)和大型卵泡(5 mm)(p0.05),而在中型卵泡和大型卵泡中的表达量没有明显的差异(p0.05)。免疫组化显色反应检测猪卵巢组织中Frizzled5蛋白的定位显示,Frizzled5蛋白在卵母细胞膜、颗粒细胞中高表达,而在基质中表达信号中等。以上结果揭示,WNT/Frizzleds信号通路可能对卵泡的发育和卵母细胞的成熟具有一定的作用。3.Frizzleds受体基因在猪卵母细胞体外成熟不同时期的表达体外分别培养猪卵母细胞38-41 h,44-46 h,48-50 h,观察其成熟率和卵裂率。结果表明,培养44-46 h时卵母细胞体外培养质量最好,其成熟率明显高于培养38-41h和48-50h(p0.05),其卵裂率明显高于38-41 h(p0.05),而与培养48-50h比较,没有明显差异(p0.05)。由此证明培养时间过短或者过长均会影响卵母细胞的体外成熟质量。试验采用实时定量PCR法分析Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5和Frizzled7mRNA在不同培养时间卵母细胞中的相对表达水平。结果显示,Frizzleds家族mRNA表达量随培养时间发生变化,且趋势不一致。Frizzled5在体外培养22 h的卵母细胞中的表达量明显高于培养0 h和培养44 h的表达量(p0.05)。Frizzled3在体外培养22h的卵母细胞中的表达量明显高于0h(p0.05),但与培养44 h时比较,没有明显不同(p0.05)。Frizzled2和Frizzled4在体外培养44 h的卵母细胞中的表达量明显高于其他两个时期(p0.05)。Frizzled7在培养44 h表达量明显低于其他两个时期(p0.05)。Frizzleds家族基因在卵母细胞中的动态变化说明了WNT信号通路可能依赖不同的受体在卵母细胞成熟过程中发挥作用。4.WNT-C59抑制剂对猪卵母细胞体外成熟培养的影响猪卵母细胞体外成熟培养基中添加WNT信号通路小分子抑制WNT-C59,并对卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。采用实时定量PCR的方法测定Frizzled5与β-catenin在WNT-C59处理前后的表达变化。结果显示,体外添加1μM WNT-C59抑制剂浓度时,明显提高了猪卵母细胞的成熟率(80.61%±2.07%)和卵裂(61.21%±4.34%)(p0.05)。并且与对照组比较,WNT-C59处理组Frizzled5与β-catenin的mRNA表达产生明显的下调(p0.05)。由此表明,WNT-C59可能通过Frizzled5下调WNT通路关键蛋白β-catenin的表达,来促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育。总之,试验检测了WNT信号通路受体Frizzleds家族在猪卵巢中的表达,并筛选出表达量最高的受体Frizzled5。该基因在猪卵泡发育不同阶段表达呈动态变化,在颗粒细胞和卵母细胞中高表达。表明WNT通路对于卵泡发育和卵母细胞成熟具有重要的作用。Frizzleds家族在卵母细胞不同发育时期差异性表达,揭示了WNT信号通路可能依赖不同的受体在卵母细胞成熟过程中发挥作用。体外添加1μM的WNT信号抑制剂WNT-C59可下调Frizzled受体和关键蛋白β-catenin的表达,进而有效促进卵丘的扩散和猪卵母细胞的体外成熟,并提高其早期胚胎发育能力。
【图文】：
图 2-1 经典 WNT 信号通路原理模式图Figure2-1 Schematic representation of the canonical WNT pathwayA.当 WNT 配体不存在时，β-catenin 与其他蛋白形成 Axin/APC/CK1/GSK3 破坏复合体并被化，被磷酸化标记的 β-catenin 被泛素化并降解；B.当 WNT 配体存在时，，与受体形NT/Frizzled/LRP 复合体并募集 Dvl 蛋白，使 Axin/APC/CK1/GSK3 破坏复合体不能形成，阻
图 2.2 WNT 非经典通路模式图Figure 2.2 Non-canonical WNT signaling pathwayPCP 通路可以激活 RhoA/Rac 介导的 JNK 激酶；另外，WNT/ca2+通路可以诱导细胞内钙离的提升，激活钙素依赖激酶（CAMK）和蛋白激酶 C（PKC）等酶。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828
【参考文献】
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本文编号：
2525825
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