猪流行性腹泻病毒感染PK-15细胞miRNA表达谱变化及其对病毒增殖影响的初步研究

发布时间：2019-08-19 10:25

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diahorrea Virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diahorrea, PED)是严重危害我国养猪业的肠道传染病。目前,还没有有效的治疗措施及治疗药物能对PED进行治疗。控制和预防PED的主要途径之一是疫苗接种,但有研究表明有些猪场在接种该疫苗后,猪群还是被PEDV感染致病并大量传播。究其原因可能是PEDV不同毒株之前发生了比较大的变异,致使疫苗免疫失效。因此,找出更加有效地防治PED的手段具有重要意义。在生物机体内miRNA是一类非编码的小RNA。miRNA作用非常广泛,能调控细胞的生长和分化以及新陈代谢和凋亡等重要的生命过程。随着研究的深入,发现具有抗病毒功能的miRNA越来越多,且miRNA发挥作用的区域可直接是病毒基因保守序列,所以miRNA对同一病毒的不同毒株都有抗病毒作用。为研究猪流行性腹泻病毒对PK-15细胞miRNA表达谱的影响,将PEDV感染PK-15细胞后,提取总RNA,进行高通量测序,构建感染PEDV的PK-15细胞以及未感染的细胞的miRNA表达谱,并进行差异性分析。试验结果发现,有214个1niRNA显著性差异表达,其中175个miRNA表达上调,39个miRNA表达下调。选取10个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证,结果显示RT-qPCR验证的各miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致。为研究差异表达的miRNA对病毒增殖的作用,结合靶基因预测、miRNA表达谱以及己报道与免疫有关的miRNA,本试验选取ssc-let-7f以及其它6个miRNA合成miRNA minics转染到PK-15细胞中,并接种PEDV,取样进行荧光定量PCR,观察转染miRNA后PEDV病毒含量的变化,验证各miRNA对病毒增殖的作用。其结果显示,ssc-let-7f在12h、24h及36h的时候均对PEDV的增殖有明显的抑制作用。说明ssc-let-7f对PEDV的体外感染有一定的抑制作用。本试验是首次对PEDV感染猪肾细胞PK-15后miRNA表达谱的进行研究,为进一步阐明miRNA对宿主先天性免疫系统的分子调控机制提供依据,对PED的防治提供新思路,更为进一步揭示miRNA的抗病毒机制,miRNA与PEDV之间复杂的关系以及深入研究PEDV的致病机制提供理论参考依据。
【图文】：

序列,蛋白,基因,纤突蛋白

（３’邋ＵＴＲ）内有一段序列为ＧＧＡＡＧＡＧＣ的保守序列，，其后面连着Ｐｏｌｙ（Ａ）序列，总长逡逑为３３４ｎｔ，ＰＥＤＶ基因组含有６个ＯＲＦ在编码区中，从５’到３’端分别为Ｐｏｌ基因、逡逑Ｓ基因、ＯＲＦ３基因、ｓＭ基因、Ｍ基因和Ｎ基因（如图１－２），其中Ｓ基因、ｓＭ基因、逡逑Ｍ基因和Ｎ基因均编码结构蛋白，编码的依次是纤突蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白和逡逑核衣壳蛋白，Ｐｏｌ基因和０ＲＦ３基因编码非结构蛋白，编码的依次是复制酶多聚蛋白逡逑和ＯＲＦ３蛋白Ｐ５１。逡逑Ｐｏｌ逦Ｓ邋ＯＲＦ３邋ｓＭ邋Ｍ邋Ｘ逡逑图１－２邋ＰＥＤＶ基因的结构逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ｔｈｅ邋ＰＥＤＶ邋ｔｈｅ邋ｇｅｎｅ邋ｓｔｒｕｃｔ：ｕｒｅ逡逑１．３．１邋Ｓ基因及其编码的Ｓ蛋白逡逑Ｓ基因的长度为４１５２ｎｔ，编码纤突Ｓ（ｓｐｉｋｅ）蛋白，Ｓ蛋白由１３８３个氨基酸（ａａ）组逡逑成ＰＷ。Ｓ基因的启动密码子不能启动蛋白质的合成，只能用于翻译多肤。Ｓ蛋白上逡逑３逡逑

机制,聚合酶,序列

生物学界研巧的热口方向。逡逑２．２邋ｍｉＲＮＡ的形成逡逑如图１－３，邋ｍｉＲＮＡ的形成是一个复杂的包含很多步骤的过程。ｍｉＲＮＡ是被更大逡逑的一类含有茎－环（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐｅ）的结构ＲＮＡ剪切加工形成的，而这类ＲＮＡ邋—般能形逡逑成不止一个ｍｉＲＮＡ。这类较长的ＲＮＡ序列被称为ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ，经过研究人员对这类逡逑ＲＮＡ的研巧表明，在动植物中ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ邋—般具有较长的序列，且还具有类似逡逑ＲＮＡ聚合酶ＩＩ有３＇端的ＰｏｌｙＡ尾和５＇端的帽子结构等的转录特征。不仅如此，逡逑ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的启动子序列还包含在ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ的上游，ｍｉＲＮＡ通过Ｍｅｆ２、ｍｙｏＤ、逡逑ＮＦＩ－Ａ等转录因子及一些与血清反应的因子结合上其５＇端的ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的启逡逑动子序列，则可调控ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的启动子的活性，达到调节ｍｉＲＮＡ序列表达逡逑的目的ｔＷ。在动物体内，经过两次加工剪切后的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ能形成成熟的ｍｉＲＮＡ。逡逑首先
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

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