鹅产蛋性能相关遗传变异的全基因组发掘及候选基因研究

发布时间：2019-09-20 01:15

【摘要】：鹅具有很强的就巢性和低产蛋性能,产蛋性能作为鹅养殖生产中一项重要的经济性状,它与鹅产业发展、养殖企业的经济效益密切相关。但产蛋性能是一个低遗传力性状,其表型值受非遗传因素影响较大,运用传统表型选育的方法很难提高,严重阻碍了鹅产业化发展。分子标记辅助选择(MAS)技术作为分子生物学水平上选择目标性状的有效技术措施,具有适合低遗传力性状、不受环境影响和选择结果可靠等特点,但其前提是找到与目标性状关联的分子标记或功能基因。为发掘鹅产蛋性能相关分子遗传标记,本研究首先运用简化基因组测序(RAD-sequencing)技术筛选产蛋性能高组与低组中等位基因频率差异显著的SNP,进一步在大群体中验证分析候选SNP与鹅产蛋量的相关性。在此基础上克隆SNP所在基因,对基因的结构和功能进行研究。最终,将本研究鉴定的两个分子标记与鹤场选育工作结合,开展鹅产蛋性能分子标记辅助选育的初步探索。主要实验结果如下:1、运用简化基因组测序(RAD-sequencing)技术筛选产蛋性能相关SNP本实验共采集492只健康扬州鹅血液样品,为保证能筛选出大量准确可靠的分子遗传标记,利用个体表型值选择、个体估计育种值和家系内选择三种方法分别建立了3个高产蛋量DNA池(HIPV、HEBV、HF)和3个低产蛋量DNA池(LIPV、LEBV、LF)。RAD-sequencing结果显示在HIPV和LIPV组,共产生4.0Gb数据,4355万条Clean Reads,分别获得893,579和992,670个RAD-tag,最终共得到96,848个群体SNP标记。对于HEBV和LEBV组,共产生3.8Gb数据,4229万条Clean Reads,分别获得942,117和884,827个RAD-tag,最终共得到139,013个群体SNP标记。对于HF和LF组,共产生4.4Gb数据,4795万条Clean Reads,分别获得898,219和953,964个RAD-tag,共得到95,889个群体SNP标记。运用卡方检验分别分析HIPV和LIPV、HEBV和LEBV、HF和LF三组SNP等位基因频率分布差异。经Bonferroni矫正后,在HIPV和LIPV组共得到25个差异显著SNP(P5.2×10~(-6))。在HEBV和LEBV组共得到467个差异显著SNP(P3.69×10~(-7)),在HF和LF组共得到817个差异显著SNP(P5.2×10~(-6))。通过计算遗传分化系数FST评价高低组间遗传差异大小,比较三种方法组建产蛋性状高低组的效果。结果显示个体表型值选择的FST为0.073,小于个体估计育种值选择(0.093)和家系内选择(0.101),表明个体表型值选择法高低组间遗传差异较小,选择准确性较另外两种方法低。因此,在候选产蛋相关SNP的挖掘中,本研究主要集中于个体估计育种选择和家系内选择法。运用AS-PCR分型技术,在HEBV(n=10)和LEBV(n=10)组共获得55个SNP的个体基因分型,其中10个SNP高低组间等位基因频率差异显著(P＜2.44×10~(-4)-4.63×10~(-10))。在HF(n=14)和LF(n=10)组共获得37个SNP的个体基因分型,其中5个SNP高低组间等位基因频率差异显著(P＜1.80×10~(-4)-8.04×10~(-)8)。将高低组间验证差异显著的候选SNP进行群体验证,结果显示其中8个SNP与鹅产蛋性能显著相关。运用线性回归模型对8个显著影响产蛋量的SNP进行多标记回归分析,发现Record-111407、106975和112359三个SNP能共同影响鹅产蛋量。基于8个SNP所在RAD-tag序列,运用反向PCR技术,获得8条延长的核苷酸序列。经BLAST比对和同源基因检索,获得Record-106975、134172、112359、106582和111407五个SNP对应的功能基因,分别为膜结合鸟苷酸激酶1(M4GI1)、KIAA1462、Rho GTP酶激活蛋白21(ARHGAP21)、乙酰辅酶A合成酶2(ACSF2)、星形肌动蛋白2(ASTN2)。研究表明这8个SNP和5个基因将为鹅产蛋性能改良提供新的研究思路。2、ACSF2基因克隆及基因表达分析鹅乙酰辅酶A合成酶2(ACSF2)基因编码区序列全长1770bp,编码589个氨基酸,其核苷酸序列与禽类其它物种ACSF2基因同源性较高,其中与鸭、鸡的序列一致性为88.20%、76.55%。在鹅卵巢中发现4种剪接体,分别命名为ACSF2-1、ACSF2-2、ACSF2-3和ACSF2-4,其中ACSF2-1为优势剪接体(1770bp)。ACSF2-2、ACSF2-3和ACSF2-4编码区序列全长分别为1692bp、1599bp、1917bp,分别编码563、532、638个氨基酸。与优势剪接体(ACSF2-1)相比,ACSF2-2在第14外显子缺失46bp,发生可变的5'端剪接。ACSF2-3完整缺失外显子7、外显子8和外显子9,同时在外显子13和14之间插入127bp(E14a)。ACSF2-4在外显子13和14之间插入E14a。ACSF2基因4种剪接体蛋白的亚细胞定位显示,4种剪接体蛋白均定位于线粒体。ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4在肾脏、卵巢、小肠、肝脏、腹脂、肌胃、胸肌、心脏、下丘脑、垂体10个组织以及卵泡颗粒细胞中均表达,而ACSF2-2基因下丘脑、垂体和卵泡颗粒细胞不表达。ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4在不同发育阶段卵泡(F1～F5、SMF、1wf、swf)颗粒细胞中均表达,其中ACSF2-1表达量高于ACSF2-3和ACSF2-4。采用Real-time PCR对鹅高低产蛋组(HEP、LEP)卵巢组织中ACSF2基因mRNA表达水平进行检测。结果显示HEP卵巢组织中ACST2基因mRNA表达水平极显著低于LEP(P0.01),同样HEP卵巢组织中ACSF2-2,ACSF2-3和ACSF2-4 mRNA表达水平显著低于LEP(P0.05)。卵泡颗粒细胞中ACSF2基因过表达实验表明,转染ACSF2-1、ACSF2-3和ACSF2-4后,颗粒细胞Caspase-3 mRNA表达水平均极显著高于对照组(P0.01)。siRNA干扰实验发现siRNA771和siRNA1381能显著抑制ACSF2基因在卵泡颗粒细胞中mRNA表达,ACSF2基因敲减导致卵泡颗粒细胞中Caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。本研究表明ACSF2基因表达与鹤产蛋性能相关,其表达水平影响卵泡颗粒细胞中Caspase-3表达水平,揭示ACSF2可能在卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡过程中发挥重要作用。3、MAGI1基因克隆及基因表达分析鹅膜结合鸟苷酸激酶1(MAGI1)基因编码区全长4152bp,编码1383个氨基酸。MAGI1核苷酸序列与禽类其它物种ACSF2基因同源性较高,鹤与鸡之间一致性为90.98%。在鹅卵巢中发现5种剪接体,分别命名为MAGI1-1、MAGI1-2、MAGI1-3、MAGI1-4和M4GI1-5,其中MAGI1-1即为优势剪接体(4152bp)。MAGI1-2、MAGI1-3、MAGI1-4和MAGI1-5编码区序列全长分别为4116bp、3945bp、4149bp和2805bp,分别编码1371、1314、1382和934个氨基酸。MAGI1基因在鹅卵巢、卵泡颗粒细胞、腹脂以及肌胃中表达量较高、其次为肾脏,下丘脑和垂体中表达量最低。在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中,MAGI1基因在等级卵泡F2中表达量显著升高,在F1、F3、F4、F5卵泡表达量较低。MAGI1基因在等级前卵泡syf、lwf、swf中表达水平一致,且低于F2卵泡。采用Real-time PCR对鹤HEP和LEP卵巢组织中MAGI1基因mRNA表达水平进行检测,结果显示HEP卵巢组织中MAGI1基因mRNA表达水平显著低于LEP(P=0.05)。卵泡颗粒细胞中MAGI1基因过表达实验表明,转染MAGI1-1、MAGI1-2、MAGI1-3和MAGI1-4后,颗粒细胞中Caspase-3 mRNA表达水平均极显著高于对照组(P0.01)。在siRNA干扰实验中,siRNA507和siRNA847能显著抑制MAGI1基因在卵泡颗粒细胞中mRNA表达,其中siRNA847基因敲减效果最佳。siRNA847处理后,导致卵泡颗粒细胞中Caspase-3 mRNA表达水平显著升高。本研究表明MAGI1基因表达与鹅产蛋性能相关,其表达水平能调节卵泡颗粒细胞中Caspase-3表达,表明MAGI1可能通过自身在细胞连接中的作用,维持卵泡颗粒细胞的正常生长,从而调控卵泡的生长发育。4、PAPPA基因克隆及基因表达分析鹅妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA)基因编码区全长4884bp,包括24个外显子,编码1627个氨基酸。PAPPA核苷酸序列与禽类其它物种同源性极高,鹅与鸭序列一致性为98%。亚细胞定位预测发现PAPPA蛋白为分泌性蛋白,定位于内质网和细胞外。鹅PAPPA基因在除肝脏以外的其它组织组织中均表达,在卵巢中的表达量最高,其次为心脏、胸肌。在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中,PAPPA基因在syf、lwf和swf的表达量较高,而在等级卵泡(F1-F5)其mRNA表达水平逐渐降低。PAPPA基因在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的时空表达模式,进一步说明PAPPA基因在卵泡的生长和发育过程中发挥着重要作用。采用Real-time PCR对鹅HEP和LEP卵巢组织中PAPPA基因mRNA表达水平进行检测。结果显示PAPPA基因在HEP卵巢中mRNA表达水平高于LEP,但差异不显著(P0.05)。PAPPA基因在卵泡颗粒细胞中过表达显著降低Caspase-3基因的表达(P0.01),且随着PAPPA基因过表达量的升高而降低。本研究表明随着卵泡的生长,PAPPA基因在颗粒细胞的表达不断降低,同时PAPPA基因上调能显著降低颗粒细胞中Caspase-3的基因表达,虽然在高低组卵巢中PAPPA基因mRNA表达无显著差异,但分析认为PAPPA基因与卵泡颗粒细胞的生长相关,且参与卵泡的生长发育调控。5、鹅分子标记辅助选择育种本实验采集第七世代(2014年)400只成年健康扬州母鹤和第九世代(2015年)596只幼鹅(公鹅221只,母鹅375只)血液样品,并完成Record-106582、106975和1111407三个SNP在第七代鹅群的基因分型,结果表明Record-106582 AA和CA基因型产蛋量显著高于CC基因型(P0.05),AA与CA基因型差异不显著(P0.05)。Record-106975三种基因型间产蛋量差异不显著,但GG基因型产蛋量高于AA基因型4.4个(P0.09),高于全群平均产蛋量(69.72±20.98)7.2个。Record-111407三种基因型间产蛋量差异不显著(P＞0.05)。最终确定Record-106582和106975作为产蛋性能分子标记。根据女儿生产记录计算第七世代公鹅估计产蛋量,同时结合第七世代母鹅产蛋量估计第八世代公鹅的个体产蛋性能;第八世代母鹅产蛋性能以前20周产蛋量表示。根据第八世代鹅场实际选配方案,选择39只高产公鹅与78只高产母鹅的后代作为留种群(第九世代),共596只,其中公鹤221只,母鹅375只。根据Record-106582、106975在留种群基因型分析结果,最终组建两个高产纯合基因型核心群,分别为141只(公鹅39只,母鹅102只)和280只(公鹅76只,母鹅204只)。
【图文】：

家禽,成熟卵泡,卵泡,结构示意图

丽和睾丽含量要显著高于正常生长巧泡［ｕ］。家禽卵泡的闭锁同样具有等级性特征，闲逡逑锁主要发生在等级前卵泡，而等级卵泡极少发生闭锁。在家禽正常生殖周期中，卵泡逡逑闭锁多发生于直径２－８ｍｍ的卵泡（图１－３）。逡逑４逡逑

闭锁卵泡,产蛋鸡,卵泡,卵泡闭锁

婭屖弱？二！ｉｒ■sD壚^沐义锨汕汕慑五义贤迹保布仪莩墒炻雅萁峁故疽馔迹郏保蒎义希疲椋珏澹保玻澹樱悖瑁澹恚幔簦椋沐澹洌椋幔纾颍幔礤澹铮驽澹恚幔簦酰颍邋澹妫铮欤欤椋悖欤邋澹椋铄澹校锷剑簦颍澹铮觯幔颍椋幔铄义希保臣仪萋雅莸谋账义下雅荼账锹雅莘⒂桃恢终５纳硐窒螅饕夤郾硐笪雅荼湫位蛩荨㈠义下鸦莆镏实娜嬉夯准奥雅荼砻嬗醒摺Ｂ雅荼账诼雅莘⒂娜魏问逼诙蓟岱⑸义系雅莸谋账饕蟹⑸冢玻福恚淼穆雅荨Ｔ诩仪菅成校奥实母叩椭麇义弦【鲇诼雅荼账氖俊＃牵酰穑簦岬茸芙嵝缘慕椅衙荼账治街中停捶潜彦义闲秃捅研吐雅荼账７潜研捅账饕⑸谥本缎∮冢担埃埃酰淼穆雅荩硐治雅蒎义夏谌菸镂眨は赴涂帕Ｏ赴掷搿１研捅账饕⑸谥本洞笥冢担埃埃酰淼穆雅荩义现饕氐阄雅荼谄屏选⑾赴庖纾郏保保荨＃耍铮觯幔螅愕龋ǎ保梗梗玻┒员确治隽撕咨ず捅账义下雅萸穑芯勘砻鲝I闭锁卵泡中胆固醇和类固醇酶的含量较高
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S835

【参考文献】