日粮中添加单宁对绵羊和绒山羊瘤胃细菌数量和多样性影响

发布时间：2019-09-21 20:03

【摘要】：本论文运用实时荧光定量PCR (qPCR)技术研究了饲粮中添加不同水平的单宁和高单宁饲粮条件下添加聚乙二醇(PEG)对绵羊和绒山羊晨饲前(Oh)以及晨饲后6h瘤胃全食糜、液相和固相附着的总细菌、厌氧真菌、3种瘤胃优势纤维降解细菌、3种蛋白降解细菌以及产甲烷菌数量的影响；同时运用16S rRNA高通量测序技术分析了晨饲前(0h)绵羊和绒山羊瘤胃全食糜中细菌多样性的变化规律,以期从瘤胃菌群数量和多样性的角度分析单宁对绵羊和绒山羊的抗营养作用机理,从而为开发我国富含单宁的非常规饲料资源提供理论依据。本研究选用1.5-2周岁、体重45kg左右、安装有永久性瘤胃瘘管的绵羊和绒山羊各4只。试验分为四个处理组,分别为试验Ⅰ组(对照组,即基础饲粮组)、试验Ⅱ组(基础饲粮+占基础饲粮2%的单宁),试验Ⅲ组(基础饲粮+占基础饲粮6%的单宁)和试验Ⅳ组(基础饲粮+占基础饲粮6%的单宁+占基础饲粮12%的PEG)。试验分四期进行,每期试验为期30d,其中预饲期12d,正试期18d。在每期试验正试期第1d,分别在晨饲前(0h)晨饲后6h从试验动物瘤胃腹囊中采集瘤胃内容物,分为全食糜、固相和液相三部分,样品于-80℃保存。提取瘤胃全食糜、固相和液相中附着微生物的粗DNA,运用RT-PCR技术测定绵羊和绒山羊瘤胃总细菌、厌氧真菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸拟杆菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌、牛链球菌和产甲烷菌的数量；根据菌群数量的结果,提取0h绵羊和绒山羊瘤胃全食糜的粗DNA,通过16SrRNA高通量测序技术分析单宁对绵羊和绒山羊瘤胃细菌多样性的影响。试验结果表明：1)添加不同水平单宁在0h主要影响瘤胃全食糜中的菌群数量,与试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ组和Ⅲ组瘤胃总细菌、厌氧真菌、三种纤维降解菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌和产甲烷菌的数量显著降低(P0.05)；添加不同水平单宁在6h主要影响瘤胃固相内容物中的菌群数量,其中瘤胃总细菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸拟杆菌、普雷沃氏菌、丁酸弧菌、产甲烷菌数量试验Ⅱ组和Ⅲ组显著低于试验Ⅰ组(P0.05)。2)添加PEG后,绵羊和绒山羊0h瘤胃全食糜总细菌、厌氧真菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、普雷沃氏菌、牛链球菌数量显著高于试验Ⅱ组(P0.05)；6h瘤胃全食糜总细菌、厌氧真菌、黄色瘤胃球菌数量和瘤胃固相产琥珀酸拟杆菌、普雷沃氏菌、产甲烷菌数量试验Ⅳ组显著高于试验Ⅱ组和Ⅲ组(P0.05)。3)羊种之间比较发现,Oh瘤胃全食糜厌氧真菌、黄色瘤胃球菌、牛链球菌、丁酸弧菌数量绵羊显著高于绒山羊(P0.05)；6h瘤胃固相黄色瘤胃球菌、产甲烷菌数量山羊显著高于绵羊(P0.05)。4)多样性分析结果显示,绵羊和绒山羊不同处理组瘤胃细菌菌群多样性和丰度存在差异。两羊种均以试验Ⅱ组菌群多样性最高,Ⅰ组最低。羊种间比较发现,绵羊各处理组菌群多样性和丰度均高于绒山羊。5)分类学分析结果表明,各处理组绵羊和绒山羊瘤胃细菌菌群均以拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌。与对照组相比,试验Ⅱ组拟杆菌门相对丰度减少,厚壁菌门相对丰度增加；试验Ⅲ组厚壁菌门相对丰度减少,变形菌门相对丰度增加。在属水平上,普雷沃氏菌属是绵羊和绒山羊的优势菌属(相对丰度为13%-24%)。与对照组相比,绵羊和绒山羊试验Ⅱ组普雷沃氏菌属和纤维杆菌属相对丰度减少,肠道菌体属相对丰度增加。
【图文】：

瘤胃微生物,菌液

２．１．２．邋３瘤胃微生物的菌液ＰＣＲ检测逡逑目标片段在胶回收之后进行克隆，挑取得单克隆菌落于液体培养基中，摇菌过逡逑夜之后，进行ＰＣＲ检测，被确证为目的片段后送检测序，菌液ＰＣＲ结果见图７。逡逑图７邋９种瘤胃微生物菌液ＰＣＲ检测逡逑Ｆｉｇ．７邋ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｕｍｉｎａｌ邋ｍｉｃｒｏｂｅｓ逡逑注：ａ；邋ＤＬ２０００ｍａｋｅｒ邋（ｂｐ）逡逑１、２、３；黄色癌胃巧菌、产班巧酸巧斤菌、白色瘤胃球菌逡逑４、５、６：邋Ｔ醇弧菌、普雷沃氏菌、牛链球菌逦？逡逑７、８、９；厌氧真菌、总细菌、产甲糕茵逡逑２．１．邋２．邋４瘤胃厌氧真菌和８种细菌阳性克隆测序结果逡逑对阳性克隆插入片段的进行测序，结果表明阳性克隆片段与Ｇｅｎｅｎａ／邋ｂａｃｆｍ’ａ．逡逑Ａｎａｅｒｏｂｉｃ邋ｆｕｎｇｉ，邋Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ，邋Ｒ．ｃＵｂｕｓ，邋Ｒｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ，邋Ｆ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ，邋３１１巧１＾＼＞化的0逡逑彟旅ｏ／ｖｅｎｓ，邋＿Ｐｒｅｖｏｔｅ化况ｒｅｐ化ｃｏｃｃｕｓ逦的片段同源性很高，分别是９７％、１００％、逡逑９１％、９７％、９５％、９３％、９８％、９４％、１００％，且包含完整的引物序列，说明成功构逡逑建了有目的片断的质粒，该质粒可用于质粒标准品的制作（测序结果见附录）。逡逑

解曲线,丁酸,弧面

不同的ＰＣ艮产物其烙解曲线也不同，从扩增和烙解曲线可Ｗ看出是否有引物逡逑二聚体等非特异性干扰。图１７￣２５分别为白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产哶巧酸逡逑拟杆菌、产甲晓菌、厌氧真菌、总细菌、普雷沃氏菌、牛链球菌和下酸弧菌的巧光逡逑定量ＰＣＲ扩增和烙解曲线。从扩增曲线图可Ｗ看出不同处理组均检测到了巧光信逡逑号；从溶解曲线图可Ｗ看出，各自烙解曲线的退火温度唯一，说明ＰＣＲ产物单一，逡逑
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827;S826

【参考文献】