重组大肠杆菌毒素蛋白LT-IIc1B-Stx2B-STa13的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究

发布时间：2019-09-22 02:08

【摘要】：犊牛大肠杆菌性腹泻是由致病性大肠杆菌感染犊牛引起的一种常见临床疾病,主要表现为腹泻、脱水或败血症,是新生犊牛死亡的主要病因之一,给养牛业带来严重的经济损失。目前治疗大肠杆菌病主要应用抗生素,但药物治疗的效果越来越差,因此研制有效预防犊牛大肠杆菌性腹泻的疫苗对预防该病的发生具有重要意义。引起犊牛腹泻的大肠杆菌主要毒力因子包括黏附素、肠毒素(包括LT、ST)和志贺毒素。肠毒素包括不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)和耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。其中不耐热肠毒素又分为LT-I和LT-II两种亚型;志贺毒素也分为两种,分为1型和2型,志贺毒素1型的毒性要弱于志贺毒素2型。本研究旨在通过将STa的13位氨基酸基因突变与LT-IIc1的B亚基和Stx2的B亚基,通过融合PCR技术串联获得重组蛋白,并以此作为免疫原研究其诱导小鼠体液免疫的情况,为犊牛大肠杆菌疫苗的研究提供实验数据。本研究经PCR分别扩增出LT-IIc1B、Stx2B两段基因与13位点突变的STa基因,通过柔性linker连接并插入到p MD-18T Simple载体中,经序列分析鉴定后,将融合基因插入到表达载体p HUE中,转化宿主菌Rosetta,构建重组表达菌Rosetta/p HUE-LT-IIc1B-Stx2B-STa13。诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,表达的重组蛋白LT-IIc1B-Stx2B-STa13分子量大小约为38ku,为包涵体表达,Western blot鉴定结果证明,表达的重组蛋白LT-IIc1B-Stx2B-STa13分别与His单抗和STa单抗发生特异性反应。选取6周龄的清洁级昆明小鼠,将其分为三组(A组、B组和C组),每组10只(5只正常、5只妊娠),A组腹腔注射重组蛋白包涵体;B组腹腔注射纯化重组蛋白;C组腹腔注射PBS对照,免疫三次,每次免疫间隔14d。定期采集A、B、C三组的小鼠血清。间接ELISA检测结果显示:重组蛋白包涵体(A组)、纯化重组蛋白(B组)均能使小鼠产生特异性免疫反应。A组三免后抗LT-IIc1B血清抗体效价可达到1:15130,抗Stx2B血清抗体效价为1:10000,抗STa13血清抗体效价为1:9744;B组三免后抗LT-IIc1B血清抗体效价为1:11410,抗Stx2B血清抗体效价为1:9017,抗STa13血清抗体效价为1:8807;C组未产生血清抗体效价。A组和B组的妊娠小鼠同样产生较高的血清抗体效价,两组乳鼠在30d时仍有效价;C组未产生效价。正常小鼠三免后14d,各组腹腔注射10LD50的Stx2毒素,结果显示,A、B两组小鼠均能得到保护,对照组C组小鼠死亡。乳鼠灌胃实验结果显示,重组蛋白包涵体组和纯化蛋白组小鼠血清均可中和STa毒素,无肠积液的产生,对照组仔鼠全部死亡。将三免后的各组小鼠血清系列稀释后,分别在Y-1细胞和Vero细胞上进行针对LT-IIc1和Stx2对的体外中和试验。结果显示,A组血清对LT-IIc1的中和效价为1:40.22,B组为1:20.11;A组血清对Stx2的中和效价为1:25.28,B组为1:12.64。研究表明,重组蛋白LT-IIc1B-Stx2B-STa13可以诱导小鼠产生良好的体液免疫应答,所产生的血清抗体对肠毒素LT-IIc1、STa及志贺毒素Stx2具有中和作用,该重组蛋白可作为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗的候选抗原。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【参考文献】