江苏部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查及其致病性研究

发布时间：2019-09-25 09:29

【摘要】：猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),的DNA病毒,其核酸分子为单股、首尾闭合的环状结构,无囊膜。PCV目前有两个基因型PCV1和PCV2。PCV2又可分为5个亚型PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、和PCV2e。PCV2本身不致死猪,但可造成免疫抑制。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,当与其它病原混合感染时,可加重病猪的死亡,给养殖业带来巨大的损失。近些年来,猪圆环病毒2型(PCV2)的基因亚型持续发生演变,让流行形势变得复杂。本文通过采集江苏部分地区病死猪的病料及扬州某规模化屠宰场样品,利用PCR方法对六种常可发生混合感染的病毒即猪圆环病毒Ⅰ型(Porcine circovius type 1,PCV1)、猪圆环病毒 Ⅱ 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)进行检测,对检测为 PCV2阳性的病料用Dulac细胞进行病毒的分离纯化和毒力测定。对部分纯化的毒株测序并作遗传进化分析,为该病的流行及变异情况提供相关的数据。另外,挑选部分分离株作人工感染实验可更好地研究该病毒的致病机理,为疫苗研究打下基础。研究1.2015-2016年江苏部分地区PCV2及几种常见病原的流行病学调查2015～2016年间在江苏部分地区共采集575份病死猪淋巴结组织检测发现,46份病料为PCV1阳性;287份病料为PCV2阳性;133份病料为PPV阳性;80份病料为PRV阳性;34份病料为PRRSV阳性;39份病料为CSFV阳性;PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV阳性率分别为8%、50%、23%、14%、6%和7%:其中在混合感染中,以PCV2和PPV的混合感染率最高,有70份,占总数的17.5%;PCV2和PCV1的混合感染有46份,占总数的11.5%;PCV2和PRV的混合感染有35份,占总数的8.7%。为了监测江苏部分地区PCV2的流行特点,在2015～2016年间采集病死猪病料用PCR技术检测PCV2病毒核酸,对检测为阳性的样品进行病毒分离和测序,共测得28株PCV2病毒全基因组,绘制遗传进化树。,全长为1767 bp的分离株有27株,1株为1766 bp。测得的毒株分属于PCV2b和PCV2d两个基因亚型,属于PCV2b亚型有7株,属于PCV2a亚型1株;其余为PCV2d亚型。对28株PCV2 ORF2编码氨基酸序列比对分析表明,PCV2基因型及亚型具有其特异的氨基酸变异位点。而2015-2016年间在江苏部分地区的PCV2流行毒株主要为PCV2d亚型。研究2.猪圆环病毒2型(PCV2)分离株致病性研究为了解当前流行的PCV2d毒株的致病性,从分离株中挑选151107 YZ株和160924 YC株作动物致病性实验。首先,用本室的Dulac细胞对上述分离株分离并盲传,让病毒适应细胞且达到较高滴度。取盲传第3代、第7代、第10代的病毒液提取DNA用PCR检测和测定TCID50可以发现随着传代次数的增加病毒滴度逐渐上升,并在10代左右达到稳定状态。将PCV2抗体阴性猪随机分为3组:健康对照组2头;感染151107 YZ组3头;感染160924 YC组3头。接种后第3、7、10、14、17、21 d采集血样检测PCV2的抗体和DNA水平;攻毒后21 d扑杀所有试验猪,并采集样品制作病理切片。结果表明:PCV2分离株可适应Dulac细胞并可稳定地增殖。IFA试验结果显示,选取的两个分离株TCID50值均可达到106.0/mL以上。在人工感染试验中,试验组在攻毒后第7 d均出现病毒血症且PCV2的病毒核酸载量也达到高峰。组织病理学观察结果显示,攻毒猪均出现由PCV2引起的不同程度病理损伤。
【图文】：

条带,特异性,特异性检测,对分

板以及ＰＲＲＳＶ与ＣＳＦＶ经ＲＴ－ＰＣＲ得到的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出６条特异性条带，逡逑条带对应大小分别为邋６８５邋ｂｐ、５６９ｂｐ、５１１邋ｂｐ、２７７邋ｂｐ、３７７ｂｐ、２８８邋ｂｐ邋（图邋１－１）。用邋ＰＣＶ２逡逑特异性检测引物对分离株进行ＰＣＲ检测可以扩增出５６９ｂｐ特异性条带（

全基因组,测序

５００邋ｂｐ逡逑４００邋ｂｐ逡逑图１－２邋ＰＣＶ２分离株ＰＣＲ扩增结果逡逑Ｍ：邋１００邋ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋１邋？１１：邋ＰＣＶ２邋分离株邋１２：邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋１３：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑３．２邋ＰＣＶ２全基因组的分段测序与拼接逡逑将鉴定为阳性的病料样品０．２２邋ｐｍ滤器除菌后接种于Ｄｕｌａｃ细胞，盲传３代后反复冻逡逑融细胞３次，，吸取５００吣细胞上清提取ＤＮＡ。通过四段测序引物ＰＣＲ分段扩增ＰＣＶ２逡逑每段基因组，将ＰＣＲ扩增出来４条特异性的条带经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的条带送逡逑至南京金斯瑞生物有限公司测序，将测序完成的四段序列拼接出ＰＣＶ２的全基因组序列。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28

【参考文献】