5-羟色胺对奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）增殖凋亡及酪蛋白合成的调控机制

发布时间：2019-09-25 09:00

【摘要】：5-HT被认为是一种反馈性抑制泌乳和诱导乳腺退化的关键因子,但是其对奶牛乳腺上皮细胞增殖凋亡的影响及机制尚不明确。奶牛乳腺表达多种亚型的5-HT受体(HTR1B,2A,2B,4和7),选择性阻断HTR1B和HTR2A引起乳蛋白表达量升高,但其作用机制目前亦未见报道。本研究以奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T细胞系)为模型,明确5-HT对细胞增殖凋亡的影响,初步探明其作用机制,并探寻5-HT调控乳蛋白合成的信号通路。首先对MAC-T细胞进行传代培养及鉴定。观察其形态为“cobblestone”结构,生长曲线呈“S”形,反复传代和冻存,细胞形态、功能稳定并保持旺盛增殖活力,并表达上皮细胞骨架蛋白—角蛋白18。用PRL和INS处理,在mRNA和蛋白水平均检测到酪蛋白的表达。利用RT-PCR技术检测到5-HT合成限速酶TPH1,以及1B、2A、2B、4、7、5A、3A、1F、1D、2C、1E、1A等多种亚型5-HT受体的表达,表明MAC-T细胞为具有分泌活性的奶牛乳腺上皮细胞,能够合成5-HT并表达多种亚型的5-HT受体,适合作为本研究的模型。为明确5-HT对MAC-T细胞增殖与凋亡的影响,本试验用不同浓度5-HT处理MAC-T细胞12h,24h,48h,72h,利用CCK-8试剂盒测定细胞的增殖情况,发现短时间(12h,24h,48h)5-HT处理,促进MAC-T细胞的增殖。而长时间(72h)5-HT处理抑制了MAC-T细胞的增殖。选择性5-HT2B(SB204741)、5-HT2A(Ritanserin)、5-HT4(SB204070)、5-HT7(Pimozide)、5-HT1B(SB224289)受体拮抗剂处理MAC-T细胞24h,测定细胞增殖情况,发现选择性5-HT1B、4受体拮抗剂对5-HT诱导的MAC-T的增殖具有明显的抑制作用。而选择性5-HT2A、2B、7受体拮抗剂对5-HT诱导的MAC-T细胞的增殖无影响。利用200μM 5-HT处理细胞72h,20μM 5-HT处理细胞24h,RT-qPCR法检测增殖凋亡相关因子caspase3、caspase8、Bax、Bcl-2的相对表达量,发现200μM 5-HT处理细胞72h,显着抑制Bcl-2 mRNA表达,显着提高caspase3、caspase8的m RNA表达量,并引起Bax/Bcl-2值升高。而20μM 5-HT处理MAC-T 24 h,Bax/Bcl-2的值与对照组相比降低,caspase3 mRNA表达量显着降低。这些结果提示5-HT可通过改变Bax/Bcl-2的比值以及caspase3、caspase8的表达量来调控细胞的命运。为探寻5-HT调控酪蛋白合成的信号通路,本试验利用20μM 5-HT处理细胞48h,RT-qPCR法测定参与乳蛋白合成调节过程中的关键激酶和调节因子JAK2、STAT5、m TOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E的相对表达量。结果发现,5-HT处理后STAT5的表达显着降低,JAK2有降低的趋势。但4EBP1、eIF4E、eEF2、mTOR、rpS6Kl mRNA的相对表达量均不受影响。这提示JAK2-STAT5信号通路参与5-HT对酪蛋白合成的调控过程。总之,低浓度短时间5-HT处理可以促进MAC-T的增殖,高浓度长时间5-HT处理抑制MAC-T的增殖。5-HT对MAC-T增殖的诱导作用是通过1B、4亚型受体,而非2A、2B和7受体来实现的。5-HT可通过改变caspase3、caspase8表达、Bax/Bcl-2的值来调控细胞的增殖凋亡。JAK2-STAT5信号通路参与5-HT对酪蛋白合成的调控过程。而在MAC-T细胞中,mTOR信号通路不参与5-HT功能的调控。
【图文】：

模型图,再摄取,模型,血脑屏障

标(Yamaguchi & Hayashi,1978)。外周神经系统和中枢神经系统的 5-HT 生物合独立进行的。由于血脑屏障的作用，血液中5-HT很难进入中枢神经系统，，而5-过血脑屏障进入脑内(Rahman et al,1982)，因而成为中枢神经系统 5-HT 合成的物质。其代谢途径见下图：

体系表,程序

图 2 RT-qPCR 反应程序Figure 2 Reaction process of RT-qPCR表 2 PCR 体系表Table 2 Composition of PCR system
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823

【共引文献】