山羊白介素-1β启动子及牛β酪蛋白增强子黄色葡萄球菌诱导活性分析
发布时间：2019-09-28 07:20
【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)诱发的乳腺炎一直是抗乳腺炎机理研究中较为复杂且重要的部分。其在临床上多呈慢性、亚临床性、反复性发病,给奶山羊养殖业造成巨大的经济损失。在抗乳腺炎的研究中,乳腺特异性细菌诱导系统致力于抗菌蛋白在乳腺中的病理可调控性,能够兼顾动物乳腺不同生理时期的对病原抵抗力特征状态。白介素-1β(Interlukin-1,IL-1β)作为乳腺炎早期大量表达的细胞因子之一,在S.aureus诱发乳腺炎中扮演重要角色,其启动子可作为细菌诱导表达系统构建的重要候选。160 bp的牛β酪蛋白增强子(bovineβ-casin enhancer,BCE)含有响应催乳素和乳腺细胞外基质的应答元件,能够特异性增加外源基因在乳腺中的表达。因此,二者结构的有效组合和功能互补对构建细菌诱导乳腺特异性表达系统具有重大意义。本实验通过对山羊IL-1β启动子区域的多物种比对并结合相关文献的报道,初步预测出了两段近缘物种同源性较高的重要功能区域——远端增强区(-4161/-3653)和近端转录起始区(-651/+85)。并以高保真重叠延伸PCR的方法成功克隆出了山羊IL-1β4582bp的启动子区(包含部分CDS区)与688bp的第一内含子区。实验通过构建双荧光素酶报告载体,以5’端选择性截短的方式初步探讨了金黄色葡萄球菌诱导下山羊IL-1β启动子不同区域在293T细胞、小鼠巨噬细胞系Raw264.7和小鼠乳腺上皮细胞系HC11三种细胞中的活性以及BCE对356bp的远端增强区的增强作用的位置效应。实验结果表明包含潜在NF-κb结合位点的IL-1β远端增强区(-3911/-3555)对其他启动子片段具有非组织依赖的增强作用。实验通过将其下游依次插入近端启动子区(-560/+5)和第一内含子区(+801/+1489)能够有效响应金黄色葡萄球菌的诱导,而缺失远端增强区或第一内含子区任一部分则不能响应该诱导作用。因此山羊IL-1β启动子金黄色葡萄球菌诱导活性的实现可能是以上三者共同作用的结果。BCE能够增强不同启动子在293T细胞和HC11细胞中的本底活性,但不同程度削弱了启动子对金黄色葡萄球菌诱导的灵敏性。将牛BCE插入IL-1β远端增强区和近端启动子之间,启动子的活性下降,说明其对IL-1β远端增强区增强作用具有阻断效应,反之插入IL-1β远端增强区上游,则能够与IL-1β远端增强区共同增强近端启动子的启动活性。通过以上实验成果,探究了山羊IL-1β启动子区金黄色葡萄球菌诱导的响应模式以及BCE与对山羊IL-1β启动子诱导活性的影响,为金黄色葡萄球菌诱导IL-1β表达的机理研究奠定了基础,并为构建金黄色葡萄球菌诱导型乳腺特异性表达系统的构建提供了思路。
【图文】：
图 1-1 S.aureus 入侵 MEC 的不同的受体机制(Alvamurillo et al.2014)a）S.aureus 通过 FnBPs 通过 Fn 作为一个连接分子结合 α5β1 整合素宿主受体介导的细b）FnBPs 采用未知机制，通过 HSP60 与整合素和或整合素作为辅助受体通过 Fn 桥直接c）的 S.aureus 铁调节表面决定簇 B（ISDB）的 RGD 配体基序与整合素结合，内吞途d）TLR2 参与 S.aureus 的内化。CD36 作为辅助受体，识别而酰甘油酯的辅助受体，而聚体识别不同 PAMPs，如 LTA 和 SitC。在单核细胞 TLR2 定位与 LTA 在早期内涵体eLa 细胞中，通过 CD36 内化于 S.aureus。（e）宿主分子伴侣热休克蛋白直接结合的自 S.aureus 的内化，但细胞内吞途径仍然未知。igure 1．1: Different receptors and mechanisms involved in S. aureus internalization into nhagocytic cells. (a) The first mechanism described for S. aureus internalization involved theost receptor and is mediated by bacterial FnBPs via Fn as a linking molecule. (b) FnBPs interaost Hsp60 or with integrin and Hsp60 as a coreceptor through a Fn bridge, but the mechanismemains unknown. (c)The S. aureus iron-regulated surface determinant-B (IsdB) contributed tosdB most likely interacts with integrins that bind ligands with the RGD motif; however
洗脱液挂在吸附柱侧壁上，于室温静置 1 min。离心机中 9000 ×g 离心 1 min。将提取的质粒送至西京测序公司等待测序验证。2.3 实验结果2.3.1 山羊 IL-1β 启动子区的预测近端核心启动子为所有参与 RNA 聚合酶Ⅱ转录调控的因子活动的最终靶标，对转录的起始有着重要作用，在人，小鼠，虹鳟鱼上都有报道包含转录起始位点 500 bp 的近端启动子序列就具有转录活性，根据 Tiehui 等人的研究结果，我们仍使用上述预测上游增强区域的方法预测了近端核心启动子序列，，通过比对我们发现了一段长为 700 bp 左右包含部分 CDS 区（+85），牛，绵羊，山羊和人相似度较高（相似度高达 90.5%）的核心启动子序列，如图 2-2 所示。该启动子为一个含非典型 TATA box（CATAAA）的核心启动子，位于 TSS 上游 300 bp 内有两个潜在 NF-κb 结合位点，较远端的 NF-κb 结合位点已在人和小鼠上验证具有不同功能。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.27
本文编号：2543185
【图文】：
图 1-1 S.aureus 入侵 MEC 的不同的受体机制(Alvamurillo et al.2014)a）S.aureus 通过 FnBPs 通过 Fn 作为一个连接分子结合 α5β1 整合素宿主受体介导的细b）FnBPs 采用未知机制，通过 HSP60 与整合素和或整合素作为辅助受体通过 Fn 桥直接c）的 S.aureus 铁调节表面决定簇 B（ISDB）的 RGD 配体基序与整合素结合，内吞途d）TLR2 参与 S.aureus 的内化。CD36 作为辅助受体，识别而酰甘油酯的辅助受体，而聚体识别不同 PAMPs，如 LTA 和 SitC。在单核细胞 TLR2 定位与 LTA 在早期内涵体eLa 细胞中，通过 CD36 内化于 S.aureus。（e）宿主分子伴侣热休克蛋白直接结合的自 S.aureus 的内化，但细胞内吞途径仍然未知。igure 1．1: Different receptors and mechanisms involved in S. aureus internalization into nhagocytic cells. (a) The first mechanism described for S. aureus internalization involved theost receptor and is mediated by bacterial FnBPs via Fn as a linking molecule. (b) FnBPs interaost Hsp60 or with integrin and Hsp60 as a coreceptor through a Fn bridge, but the mechanismemains unknown. (c)The S. aureus iron-regulated surface determinant-B (IsdB) contributed tosdB most likely interacts with integrins that bind ligands with the RGD motif; however
洗脱液挂在吸附柱侧壁上，于室温静置 1 min。离心机中 9000 ×g 离心 1 min。将提取的质粒送至西京测序公司等待测序验证。2.3 实验结果2.3.1 山羊 IL-1β 启动子区的预测近端核心启动子为所有参与 RNA 聚合酶Ⅱ转录调控的因子活动的最终靶标，对转录的起始有着重要作用，在人，小鼠，虹鳟鱼上都有报道包含转录起始位点 500 bp 的近端启动子序列就具有转录活性，根据 Tiehui 等人的研究结果，我们仍使用上述预测上游增强区域的方法预测了近端核心启动子序列，，通过比对我们发现了一段长为 700 bp 左右包含部分 CDS 区（+85），牛，绵羊，山羊和人相似度较高（相似度高达 90.5%）的核心启动子序列，如图 2-2 所示。该启动子为一个含非典型 TATA box（CATAAA）的核心启动子，位于 TSS 上游 300 bp 内有两个潜在 NF-κb 结合位点，较远端的 NF-κb 结合位点已在人和小鼠上验证具有不同功能。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.27
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 李冬野;崔玉东;胡晓亮;朱战波;侯喜林;朴范泽;;金黄色葡萄球菌β溶血素研究进展[J];黑龙江八一农垦大学学报;2009年01期
2 臧丽;李英俊;张乃生;王兴龙;周虚;;奶牛乳腺的防御机制与乳腺炎病理学[J];动物医学进展;2006年11期
相关博士学位论文 前1条
1 余源;利用位点特异性整合酶生产无抗生素筛选标记的转基因奶牛[D];西北农林科技大学;2013年
本文编号：2543185
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