基于高通量测序的犏牛囊胚玻璃化冷冻损伤机制研究

发布时间：2019-09-29 11:59

【摘要】：本研究旨在利用RNA-seq技术从转录组学角度探讨犏牛囊胚玻璃化冷冻的损伤机制。采用体外受精(IVF)技术生产犏牛胚胎(奶牛精子×牦牛卵子),以新鲜犏牛囊胚和经玻璃化冷冻复苏后的冻融囊胚为研究对象,提取总RNA,使用Smart-seq2方法进行扩增并构建文库进行高通量测序。结果表明:新鲜囊胚和冻融囊胚样本经深度测序后,分别得到51 099 116和54 192 358条Clean Reads,其中80%以上Clean Reads被比对上参考基因组。冻融囊胚相对于新鲜囊胚共筛选出11 196个差异表达基因(DEGs),其中上调表达基因有7 570个,下调表达基因有3 626个。新鲜囊胚和冻融囊胚可变剪切数分别有49 016和64 352个;SNP位点数量分别为116 681和224 750个。差异基因GO功能分析主要富集于生物过程、细胞组成和分子功能3大类;KEGG注释结果表明,冻融囊胚与新鲜囊胚间共涉及318条通路,其中14条通路显著富集。推测犏牛囊胚冷冻损伤机制可能是通过剪接体、泛素介导蛋白水解和内质网蛋白加工等通路的相互协调以及Prp19、Prp4、CaM、PKA、Hsp70、CCL2等基因的差异表达来发挥生物学作用。综上表明,本研究利用RNA-seq技术首次从转录组学角度探讨了犏牛囊胚玻璃化冷冻的损伤机制,为完善胚胎的玻璃化冷冻提供新思路,同时也为进一步完善犏牛基因结构信息和胚胎玻璃化冷冻相关的新基因提供理论基础。
【图文】：

通路分析,差异表达基因,火山,囊胚

畜牧兽医学报４８卷图３差异表达基因火山图Ｆｉｇ．３Ｔｈｅｖｏｌｃａｎｏｐｌｏｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ２．４差异基因ＫＥＧＧ通路分析为了进一步了解获得的预测蛋白的生物学功能及相互作用，将所有的预测蛋白与ＫＥＧＧ蛋白质数据库进行了比对。在犏牛冻融囊胚与新鲜囊胚间差异表达基因通路功能注释中，共有１２３１５个ｕｎｉｇｅｎｅ注释到３１８条通路，其中有１４条显著富集（表４）。其中，剪接体通路和泛素介导蛋白水解通路二者富集程度最高，且犏牛冻融囊胚相比新鲜囊胚大部分ＤＥＧｓ上调表达。筛选出重要Ｐａｔｈｗａｙ及所包含的相关差异表达基因见表５。２．５差异表达基因的ＲＴ－ｑＰＣＲ验证为验证测序结果的准确性，根据测序结果随机选取４个差异表达基因（ＤＥＧｓ）（２个上调ＤＥＧｓ，２个下调ＤＥＧｓ），并选取Ｈ２Ａ作为内参基因，采用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法验证ＤＥＧｓ的表达情况。以新鲜囊胚为基础，分别以单细胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ两种方法测得的ｍＲＮＡ表达量数据来分析基因表达差异倍数［即ｌｏｇ２（冻融囊胚表达量／新鲜囊胚表达量）］。结果表明，单细胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ两种方法计算得到的差异倍数基本一致（图５）。验证说明了高通量测序的准确性。３讨论本研究应用Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２方法对犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚进行富集扩增，充分保持原有ｍＲＮＡ种类的复杂性，保证了扩增样本的测序数据具有和原始未扩增富集样本的测序数据的一致性。使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉ

功能分类,差异表达基因,囊胚

胚表达量）］。结果表明，单细胞ＲＮＡ－ｓｅｑ和ＲＴ－ｑＰＣＲ两种方法计算得到的差异倍数基本一致（图５）。验证说明了高通量测序的准确性。３讨论本研究应用Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２方法对犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚进行富集扩增，充分保持原有ｍＲＮＡ种类的复杂性，，保证了扩增样本的测序数据具有和原始未扩增富集样本的测序数据的一致性。使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００平台对犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚进行了高通量测序，经一系列数据处理分析得到１１１９６个ＤＥＧｓ。图４差异表达基因的ＧＯ功能分类Ｆｉｇ．４Ｇｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ１８７６
【作者单位】：西南民族大学生命科学与技术学院;
【基金】：中央高校基本科研业务费专项资金项目(2015NZYTD02)
【分类号】：S823.85

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