cGAS信号通路介导牛分枝杆菌激活小鼠髓源树突状细胞免疫应答的研究

发布时间：2019-10-01 18:01

【摘要】：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M bovis)是一种导致牛结核病的典型胞内病原菌,可跨物种传播给人和其他哺乳动物。在全球造成了重大的经济损失,并威及社会公共卫生安全。近期,美籍华人科学家陈志坚教授课题组发现了一种新型的DNA识别分子,环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS),cGAS属于核苷酸转移酶成员,可特异性识别细胞质中的双链DNA,催化合成cGAMP,进而依赖STING介导的信号通路诱导Ⅰ型干扰素的产生。长期以来的研究都将巨噬细胞作为结核菌感染的主要宿主细胞,但随着树突状细胞生理功能的逐步明了,其在结核菌感染中的作用越来越受到人们的重视。本实验旨在探究小鼠髓源树突状细胞(murine bone marrow derived dendritic cell,BMDC)感染牛分枝杆菌后,cGAS 信号通路的表达,以及对BMDC成熟及活化的调控,进一步探究感染后CD4+T细胞的免疫应答,阐明相关作用机制。1.利用体外诱导的方法,原代分离BMDC,且纯度达到90%以上。通过Western blot检测感染后BMDC中cGAS及其下游相关蛋白的表达情况,利用免疫荧光显微镜观察IRF3的入核现象。结果显示,感染后cGAS、p-TBK1的蛋白表达量上升,STING表现出双条带,IRF3入核现象明显。而利用siRNA沉默cGAS后,下游相关蛋白表达均受到抑制,IRF3入核现象减弱。2.利用流式细胞术以及Ⅰ型干扰素受体阻断剂,检测感染后BMDC表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表达情况,利用ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情况。结果显示,感染后表面标志物表达量显著上升,而cGAS沉默后以及Ⅰ型干扰素受体阻断后,表达量均受到抑制。细胞因子的变化趋势基本与之相同,但TNF-α不受阻断剂的影响。添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上调,而IL-10、IL-6则无明显变化。3.利用免疫磁珠方法从小鼠的脾脏特异性分离出CD4+T细胞,添加示踪性荧光标签后,建立BMDC与CD4+T细胞共培养体系,通过流式细胞术和ELISA技术分别检测CD4+T细胞的增殖情况以及IFN-γ的分泌。结果显示,感染组可显著诱导CD4+T细胞的增殖,而阻断Ⅰ型干扰素受体后扩增能力下降。感染后IFN-γ表达量显著上调,而在阻断组中则受到明显抑制。综上所述,本研究表明,cGAS信号通路存在于BMDC中,感染牛分枝杆菌后cGAS及下游相关蛋白可被激活,并且cGAS信号通路以及Ⅰ型干扰素途径有助于BMDC表型的成熟和功能的活化,对抗原呈递起到促进作用。此外牛分枝杆菌感染BMDC后,可显著增强CD4+T细胞的扩增能力,提高IFN-γ的分泌量,诱发获得性免疫应答。
【图文】：

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在２０１５年，全球约６１０万新发病例，其中有１２．５万为多重耐药（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ逡逑Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ邋Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，，邋ＭＤＲ－ＴＢ）病人，发病于中国、俄罗斯联邦、印度尼西亚、逡逑印度、尼日利亚五国的ＭＤＲ－ＴＢ患者占到６０％以上，且ＭＤＲ－ＴＢ的成功治愈率只有５２％（图１－１邋）。逡逑中国作为世界人口大国，长久以来就是结核病氋负担国，ＷＨＯ预计在２０１６－２０２０年，中国将是逡逑ＴＢ、ＭＤＲ－ＴＢ、ＴＢ与ＨＩＶ混感的高负担国家（图１－２）邋［２］。结核菌正表现出更强的毒力和耐药性。逡逑由于抗生素的长期滥用导致多重耐药性结核和广泛耐药性结核的出现，对新药的研发不断提出挑逡逑战，对公共卫生的安全有着深远影响［３；４］。因此，深入了解结核的流行状况、致病机理、发病特逡逑点对今后有效的开展相关的预防控制和治疗策略极为关键。逡逑动物源性结核病最初发生于牛，所以又被称为牛结核。牛分枝杆菌是牛结核的主要致病菌，逡逑属于结核分枝杆菌属成员１５］。牛分枝杆菌可同时传播于野生动物、家畜和人类之间，具有重大的逡逑公共卫生学意义［６］。动物性结核直接影响动物的生产性能和相关产品，以及国际进出口贸易，具逡逑有极氋的经济相关性［７；８］？世界动物卫生组织（Ｏｆｆｉｃｅ邋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋ＤｅｓＥｐｉｚｏｏｔｉｅｓ

吞噬溶酶体,吞噬体

该酶的作用效应依赖于烟憸胺腺嘌呤二核苗酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ邋Ａｄｅｎｉｎｅ邋Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，逡逑ＮＡＤＨ）邋［７４］。虽然上述基因及其产物表现出了对活性氮和活性氧中间产物一定的抵抗作用，但这逡逑些物质发挥作用的机制有待进一步的研宄（图１－８）。逡逑丨＊ＷＷＷ丨丨逡逑Ｉ邋？ｍｍｒｎｍｍｍ＇逦｜邋ＭａｒｔｌＡＭ邋５，ｅｃｒｅ１ｅ＜ｌ邋ｂｙ邋Ｍ．邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ逡逑＼邋ｗ逦Ｉ邋Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ逡逑ｒａｆｔｓ逡逑Ｔ？ｌｈ？ｒｉｎ？ｇ邋ａｎｄ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ａｇ＃ｒ？ｔｓ逡逑？邋Ａｆ．邋ｔｕ＆ｅｔｅｉｔｋｒｓｉｓ邋ＭａｎＬＡＲｌ逡逑，．逦＾ｉ逦？邋ｖｐｓ？逡逑Ｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ邋Ｑｉｙｃｏ％ｙｉ９ｔｅａ邋Ｐ＼－ＳＰ邋ｍｉ邋ｉ邋＃逦＾逦邋Ｑ邋ｃｅａｉ逡逑在：？邋＾逡逑－0—逡逑＼ｙ－，逦今ＮＡＨＥ邋ｐｍｔｅｓｎｓ逡逑图１－７邋Ｍｔｂ抑制吞噬溶酶体融合及吞噬体成熟逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－７邋Ｍｔｂ邋ｉｎｈｉｂｉｔ邋ｐｈａｇｏｌｙｓｏｍｅ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍａｔｕｒｅ逡逑（弓邋Ｉ邋自邋Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：邋Ｉｍｍｕｎｅ邋ｅｖａｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，邋Ａｎｔｉｍａ邋Ｇｕｐｔａ邋ｅｒ．ａ／，邋２０１２邋）逡逑－１０－逡逑
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

【参考文献】