表面展示禽流感病毒HA2蛋白新功能型乳酸菌分子免疫机制的研究

发布时间：2019-10-01 23:56

【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的疾病,其具有急性,高传染性,给养禽业造成严重的经济损失,也威胁着人类健康。防控禽流感有效的途径是疫苗,但由于禽流感病毒存在抗原容易变异的特性导致疫苗防控也存在局限性,所以研制更为有效的疫苗是大家共同关注与亟待解决的难题。表达外源蛋白的新功能植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)作为新型口服免疫制剂在禽流感等粘膜免疫相关疾病的防制中具有诸多优势。聚-γ-谷氨酸合成酶A(pgsA)是乳酸菌的表面展示原件,可将外源蛋白锚定在宿主菌表面。树突状细胞诱导肽(DC-targeting peptides,DCpeps)能特异性将抗原靶向树突状细胞,增强抗原递呈能力。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)是一种粘膜佐剂,具有很好的应用前景。本实验通过pgsA’表面展示元件将禽流感病毒高度保守蛋白HA2基因锚定于植物乳杆菌表面,加入免疫佐剂LTB序列与免疫诱导肽DCpep构建新功能型乳酸菌,并对构建的具有免疫增强功能的新型乳酸菌免疫效果进行评价,具体实验结果如下:(1)pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB三组新功能型乳酸菌的构建构建重组质粒pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,电转入植物乳杆菌中,经诱导表达后,通过免疫印迹(Western blotting)实验检测新功能型乳酸菌表达蛋白的大小与免疫反应原性;通过免疫荧光实验检测目的蛋白在菌体表面的表达。实验结果:成功构建三组新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,Western blotting验证表达蛋白均有反应原性,且免疫荧光实验证明了目的蛋白通过pgsA’锚定于植物乳杆菌表面,为后期实验奠定基础。(2)新功能型乳酸菌的分子免疫机制研究将三组新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB按照免疫程序喂饲6周龄BALB/c小鼠。免疫结束后,通过流式细胞术检测各免疫器官中T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖活化情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测小鼠体内HA2特异性IgG和粘膜免疫抗体SIgA及血清内细胞因子含量。对小鼠攻毒后测量体重并计算体重丢失率、存活率。将小鼠肺部取样进行病理切片制作观察。以上实验综合结果显示:新功能型乳酸菌可提高脾脏(SPL)、肠系膜淋巴结(MLNs)中CD3+CD8+T细胞数量及分泌细胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的CD3+CD4+T细胞水平,同时增强小鼠体内CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的活化,提高B220+IgA+B细胞水平、HA2特异性IgG和粘膜免疫抗体SIgA的水平及细胞因子分泌水平。攻毒后,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep组、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB组小鼠体重在第7天达到最低,第8天起小鼠体重逐渐恢复,其余三组均在第8天体重下降达到最低,第9天起各组小鼠体重均逐渐恢复,最后趋于稳定,control组、pSIP409-pgsA’组、pSIP409-pgsA’-HA2组、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep组、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB组存活率分别为12.5%、12.5%、12.5%、25%、37.5%,新功能型乳酸菌组与control对照组和空载体组相比,体重丢失率低且体重恢复快、存活率也相对较高。肺部病理切片结果显示:新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-LTB组肺组织形态完整,炎性病变最轻,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep组肺组织形态较为完整,炎性病变较轻,pSIP409-pgsA’-HA2组抗病毒染能力较前两组低但优于对照组,三组新功能型乳酸菌免疫组与control对照组和空载体组相比可降低病毒对小鼠肺部病理损伤,缓解肺部炎性病变,对禽流感病毒的感染有一定免疫保护作用,且共表达增强组分(DCpep及LTB)的乳酸菌具有更好的免疫效果,其中佐剂分子LTB较树突状细胞靶向肽DCpep更为明显。综上所述,本实验利用pgsA’将蛋白成功锚定于植物乳杆菌NC8表面,构建了三组表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB。结果显示新功能型乳酸菌可刺激特异性IgG和SIgA抗体的产生,增强T、B淋巴细胞的活化,提高细胞和体液免疫水平,并可增强免疫力,为研制新型口服抗禽流感微生态制剂提供了依据。
【图文】：

PCR扩增产物,质粒,载体,产物

e-HA2 质粒进行 PCR，，产物电。图 1.1 pSIP409-pgsA’载体回收pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III markeFig. 1.1. Result of pSIP409-pgsA’pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III marke

质粒,产物

质粒双酶切鉴定 pSIP409-pgsA’-HA产物电泳鉴定，在 6167bp 和 697bp 图 1.3 pSIP409-pgsA’-HA2 质粒λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2;Fig. 1.3 Result of pSIP409-pgsA’ -HA2λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

【参考文献】