狂犬病病毒P蛋白与宿主RPL9的相互作用及其调控病毒复制的研究

发布时间：2019-10-13 04:12

【摘要】：狂犬病是一种人或其他温血动物的病毒性脑脊髓炎,在家畜和野生动物之间可以自然感染与传播,感染后一旦出现临床症状,致死率几乎100%。其病原体是弹状病毒科狂犬病毒属的狂犬病毒(Rabies virus,RABV)。狂犬病毒由一条单股负链RNA和五种结构蛋白组成,其中磷酸化蛋白P作为一种多功能的非催化活性蛋白,在病毒的转录和复制过程中发挥重要作用。迄今为止,虽然有研究表明狂犬病病毒P蛋白既能与其自身的结构蛋白相互作用,又能与宿主细胞的某些蛋白互作,并参与病毒的生活周期调控,但这方面的研究还相当有限,狂犬病毒的致病机致仍未完全阐明。本研究通过噬菌体展示技术,筛选出与狂犬病毒P蛋白相互作用的宿主核糖体蛋白L9,对其进行了体内、外验证,并深入研究了其对病毒复制的影响,为进一步阐明狂犬病毒的复制和致病机理奠定基础。1、RABV-P宿主相互作用蛋白的筛选为了进一步了解狂犬病毒的致病机制,探索P蛋白的生物学功能,首先从狂犬病毒cDNA中扩增并克隆了P基因,利用大肠杆菌表达并纯化了P蛋白;进一步通过人脑T7噬菌体展示技术,经过五轮筛选,用ELISA,BLAST对比和读码框校对等确定了13种与P蛋白相互作用的候选蛋白。2、L9与P蛋白相互作用的验证为了验证13种候选蛋白是否与P蛋白直接相互作用,构建了所有候选基因与GST标签的融合表达质粒,利用原核表达并纯化了相关融合蛋白。DOT-pull-down试验表明L9与RABV-P有明显的相互作用。通过GST-pull-down试验证明L9与RABV-P在体外可以直接相互作用。为了排除体外非特异的环境造成假阳性的结果,在细胞内表达了L9与P蛋白,通过Co-IP试验进一步证明RABV-P蛋白与L9相互作用。P蛋白与L9在细胞的什么部位相互作用?为了回答这个问题,构建了P融合绿色荧光蛋白GFP和L9融合表达红色荧光蛋白DsRed的真核表达质粒,共转HEK-293T细胞,共聚焦荧光显微镜观察结果显示P蛋白招募大多数细胞核中的L9蛋白共定位于细胞质中,显示P与L9在细胞质中有相互作用的可能。为了进一步确证以上结果在自然状态下能否发生,用rabv感染hek-293t细胞,间接免疫荧光试验显示l9与p蛋白仍然共定位于细胞质3、l9与p蛋白相互作用区域的确定为了确定l9与p蛋白的相互作用位点,利用pull-down实验进行了一系列研究。首先,将p基因做了p19-297、p52-297、p82-297、p138-297、p172-297、p1-137、p1-180andp1-218等8个截短,并分别表达、纯化相应蛋白,然后与带有gst标签的l9蛋白进行gst-pull-down试验,结果显示l9与p蛋白的138位至180位氨基酸区域相互作用。为了确证这一结果,我们构建了缺失该区域的表达质粒(pΔ138-180),通过类似的方法证明pΔ138-180蛋白不能与p蛋白结合,进一步验证了前面的结果。为了确定p蛋白在l9蛋白上的结合位点,根据l9蛋白结构,我们构建并表达了l91-39、l91-61、l91-85、l962-192、l986-192和l997-192等6个截短突变体。his-pull-down结果表明l9的n端39个氨基酸与p蛋白的相互作用无关。4、l9对rabv生物学功能的研究在细胞水平上过表达l9,通过检测rabv报告基因的表达水平研究l9对病毒复制的影响,结果表明过表达l9能够显著抑制rabv的复制(10-20倍);western-blot的结果显示p蛋白的表达量较对照下降了60-70%。为了进一步确证l9抑制rabv的复制是否具有特异性,在过表达l9的条件下测定了vsv的生长曲线,结果显示vsv的复制与对照没有显著差异。以上结果表明l9过表达能特异性地抑制rabv的复制。那么降低l9的表达或敲除l9对rabv的情况会是怎样呢?为了回答这个问题,合成了l9特异的sirna和无关rna。将sirna转染hek-293t细胞,感染rabv,结果显示干扰l9能够显著增强rabv复制(4-5倍);p蛋白表达量升高了50%以上。以上结果表明l9对rabv的复制具有重要的调节作用。5、l9与p蛋白互作干扰了rabv的转录为了确定l9与rabv互作发生在病毒生活周期的哪一步,我们检测了在l9过表达时病毒基因组rna和mrna的变化,研究其对复制或转录的影响,并用chx处理抑制细胞的翻译过程。结果显示,无论是否用chx处理细胞,过表达l9的情况下,病毒mrna和基因组rna的拷贝数均显著显著低于对照。为了确认此结果的特异性,在同等条件下以VSV为对象重复了上述试验,结果表明L9过表达与否对VSV的mRNA拷贝数无显著影响。
【图文】：

示意图,噬菌体展示技术,示意图,狂犬病

在300-3000 bp之间，所表达的多肽或蛋白以与噬菌体外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在50-1200aa。T7噬菌体展示筛选系统的原理和过程与其它噬菌体展示筛选系统类似 (如图1-1)图 1-1 噬菌体展示技术示意图Figrue 1-1 Phage display technology schematic diagram用噬菌体展示技术筛选狂犬病 P 蛋白与宿主细胞的相互作用的因子或伙伴蛋白成为可能，为深入研究狂犬病的致病机理提供技术支持。1.2 文献综述1.2.1 狂犬病狂犬病，又名疯狗病‖，是人或其他温血动物的一种病毒性脑脊髓炎，其病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。本病严重影响家畜和野生动物，在家畜和野生动物之间可以自然感染与传播，，并通过密切接触传染性物质，如唾液等传

狂犬病病毒,粒子,结构示意图,核衣壳

1.2.2 狂犬病病毒的结构特征1.2.2.1 狂犬病病毒的形态与结构病毒粒子呈子弹状（图1-2），直径约75-80nm, 长度约170-300nm。病毒外壳为宿主细胞来源的脂蛋白双层包膜，其表面镶嵌有大量G蛋白纤突（5-10nm,直径约3nm）。圆形糖蛋白纤突由三个糖基化的外部功能区组成，突起于病毒囊膜，连接病毒和宿主细胞受体。病毒粒子中间层则由呈螺旋形式规律排列的M蛋白组成， M蛋白形成的低聚物结合在核衣壳的外侧，保持病毒结构的硬度并提供给病毒糖蛋白及其囊膜一个结合平台。病毒粒子内层是具有实际感染力的核衣壳(nucleocapsid,NC)，核衣壳由病毒基因组RNA和紧密包裹在外面的N蛋白组成。每个N蛋白分子结合9个核苷酸分子并完全包裹病毒基因组RNA，然后形成螺旋形的、长的N-RNA复合体（Schoehn et al.,2001）。核衣壳通过很重要的比例与由297个氨基酸组成的磷酸化蛋白P相互作用
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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